“基因魔剪”致数百个非目标突变?学者:还无法排除其他可能

澎湃新闻记者 王盈颖

2017-06-03 11:56 来源:澎湃新闻

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近日,一篇发表于《自然-方法》期刊的通讯文章让不少人再次审视“基因魔剪”CRISPR的安全性。在不到千字的正文中,来自美国哥伦比亚大学等机构的研究人员称,经CRISPR基因编辑的小鼠会出现数百个意想不到的非目标突变,认为可能是CRISPR的脱靶现象引起。
但有科学家对这篇通讯文章结论的可信度打上了问号。
“由于论文提供的实验证据有限,目前还不能得出CRISPR/Cas9具有更大安全隐患的结论。”中国科学院生物物理研究所研究员刘光慧对澎湃新闻(www.thepaper.cn)表示。
中国科学院上海神经科学研究所研究员杨辉及其博士研究生唐骋持相同观点,在6月2日发表于微信公众号《知识分子》的撰文中,他们表示:“文章本身的实验和数据也只是展现一种可能性,但并不足以支撑起一个科学结论所需的完整逻辑结构。”
中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究员李伟也对澎湃新闻表示:“这篇文章的方法和结果并不令人信服,仍需同行验证。”
经过锌指蛋白和TALEN两代基因编辑技术之后,借用自然界规律的后起之秀CRISPR因为技术门槛低、效率高,成为目前全球实验室最为常用的基因编辑技术。CRISPR的中文全称是“成簇的规律间隔的短回文重复序列”,化用的是细菌免疫系统应对噬菌体的特殊机制,在向导RNA的带路下,Cas9蛋白可对目标DNA片段进行切割。
通讯文章写了什么?
在5月30日在线发表于《自然-方法》的通讯文章中,研究人员表示,通过CRISPR基因编辑技术,他们将两只盲鼠的致盲基因进行修复。
修复后,通过全基因组测序,他们发现,与未经过CRISPR编辑的小鼠相比,两只经过改造的小鼠发生了100多个基因片段的插入或缺失(indel)、上千个单核苷酸突变(SNV)。其中,有117个基因片段缺失或插入和1397个单核苷酸突变是两只盲鼠共有的。研究人员认为,这可能是因为CRISPR编辑目标致盲基因时出现了脱靶现象。
基因编辑的脱靶问题并不是一个新事物,就算第三代基因编辑技术、有“基因魔剪”之称的CRISPR也没有完全避免。所谓脱靶,指的是基因编辑工具工作时,可能“伤及无辜”,除了人们想改变的目标基因外,无意中改变了其他基因。
自从CRISPR系统问世以来,科学家们不断在提高CRISPR系统的特异性,减少脱靶现象。目前,通过计算机模拟程序,实验室里的科学家可以预测基因组中可能的脱靶位点,并重点检查模拟结果中最可能脱靶的几个区域。
但研究人员发现,他们实验中发现的这些改变是计算机模拟软件所无法预测到的,从而建议业内今后使用全基因组测序的方法来检测体内编辑后是否有脱靶导致的突变。
同行为什么认为结论可信度不高?
首先是研究的样本量。“样本量太少,无法区分‘突变’的来源,是这个研究的最主要问题。”李伟说。作为一篇简短的通讯文章,研究人员所用来得出结论的数据仅来自两只实验鼠和一只对照鼠。
杨辉觉得这样的样本量是“严重不足的”,“因为你无法分清这个结果究竟只是这一两只动物的‘个案’,还是某种普遍的规律,而只有大量的重复才能抹平一只只小鼠的‘个性’,从中总结出最普适的结论。”
在刘光慧看来,缺乏合适的实验对照也使得该研究可能流于“个性”。该研究仅仅使用了1只非注射组小鼠作为对照,严格的实验设计应该包含更多的对照以排除不同小鼠之间固有的遗传差异。他表示,即便在同一组织内,细胞和细胞之间在基因序列上也可能存在着一定的差异(即异质性);这些个体、组织、细胞之间的差异需要谨慎地排除,不能简单将其归因为基因编辑所致的突变。
杨辉和刘光慧在实验对照组的设计改进上提出了类似的看法:为了严谨性和科学性,一方面,该研究应该同时包含基因编辑小鼠的父母系作为测序的对照,这样可以部分确认突变是来自遗传还是因为基因编辑。另一方面,由于CRISPR的工作机制是在向导RNA的带领下找到目标基因,再用Cas9“剪刀”进行切割。该研究应该补充分别单独注入向导RNA和Cas9的对照实验,从而判断是否突变真的是由于CRISPR切割所造成的脱靶效应。
此外,值得注意的是,基因尤其是单核苷酸的突变在自然界无时无刻不发生着,这意味着研究人员需要排除突变是不是天工所为。“突变本来又会在DNA复制和细胞分裂的过程中自然发生,因此他观察到的突变有多少是由CRISPR引发的脱靶,是否广泛存在,仍然需要其他同行的验证。”李伟说。
利用全基因组测序的方法来评估基因编辑工具的脱靶效应,这是该通讯文章的创新之处,但刘光慧有他的担忧。
“在技术层面上,目前的全基因组测序会不可避免地报告少数‘假阳性’的突变结果,这些结果需要后续用生物信息学和Sanger测序等手段进一步‘过滤’和确证,才能最终得到确凿的结论。”刘光慧向澎湃新闻解释,理论上CRISPR/Cas9产生的大多数突变更有可能是插入缺失突变(indel),而该研究显示单核苷酸变异(SNV)似乎比插入缺失突变(indel)还要多,这些不寻常的现象需要格外加以关注。
总而言之,研究人员通过全基因组测序发现了以数百计的突变,然而,要将这些直观的“突变”与CRISPR的脱靶效应关联起来,建立确凿的因果关系,需要层层地排除其他可能性,方可定论。但目前,根据该通讯文章所呈现的实验设计、数据,诸多可能性尚无法排除。这也是刘光慧、李伟、杨辉为这篇通讯文章打上的最大问号。
科学家怎么看基因编辑的安全性争议?
对于基因编辑这一革命性的生物技术,安全性总是敏感地横亘在大众心头。此次《自然-方法》的通讯文章掀起波澜,让CRISPR技术相关的上市生物公司股价受到波动。
“在更多证据出来之前,我们既不能轻率地说CRISPR/Cas9有严重缺陷或是《自然-方法》登错了文章。”尽管对该通讯论文所得结论暂时保留意见,杨辉和唐骋表示:“CRISPR/Cas9作为一种对人类未来命运休戚相关的重要生物技术,一些谨慎的声音总是很有意义的。”
李伟相信基因编辑技术具有重要临床应用前景,谈及基因编辑的安全性问题,他说:“任何生物技术,包括基因编辑技术在内,在临床的应用都需要经过严格的安全性和有效性评估,过度的乐观和轻易的悲观都是不利于其发展的,需要足够的耐心和毅力来制定严格的安全性和有效性评估标准并完成它。”
“基因编辑技术的安全性一直是临床试验不能回避的问题,在将基因编辑应用于临床试验之前,必须确定其安全性和有效性。”刘光慧说:“从积极的方面看,该论文再一次敲响了警钟,提醒人们要严格评估任何一种临床治疗方案的安全性。其实,这对于从事基因编辑研究的科研人员来说更多的是一种激励。”
责任编辑:王盈颖澎湃新闻报料:4009-20-4009   澎湃新闻,未经授权不得转载
关键词 >> CRISPR,基因编辑,突变,安全性,澎湃,澎湃新闻

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