双光子全息光遗传学：脑活动的精准调控

撰稿 | 杨暐健 （加州大学戴维斯分校 助理教授）

说明 | 本文由论文作者（课题组）撰稿

大脑是我们最重要也是最神奇的器官。随着年龄的增大，人们患脑疾病的风险急剧增加。对大脑的深入认知不仅有助于研发治疗脑疾病的药物和方案，也可以启发新的人工智能技术。作为研究大脑的重要工具之一，如何对大脑活动进行高精度记录和调控成为近年来的研究热点。

美国加州大学戴维斯分校的杨暐健博士致力于研制先进的光学显微镜技术，并对活体小鼠脑神经活动进行高精度的记录和调控。他于2021年获得美国科学杂志和北京品驰医疗公司联合创办的Science & PINS神经调控奖（奖项介绍>>>），以表彰他在双光子三维全息光遗传学的贡献，并于2021年8月6日以唯一作者身份在《Science》发表了题为 Manipulating neuronal circuits, in concert 的文章。

图源：《science》

经Light学术出版中心（关于我们>>>）邀请，本文，杨暐健博士将介绍他近期的工作进展，并重点介绍双光子全息光遗传学技术，以及它在神经科学的应用。

光遗传学（名词解释>>>）是一种新兴的神经活动调控技术。通过基因改造技术，研究者们可以在特定类型的神经细胞上表达对光敏感的离子通道（名词解释>>>）。当受到特定波长光照射的时候，这些离子通道可以被打开，从而激发或者抑制神经活动。

相比利用药物对神经活动进行调控，光遗传学具有优异的时空特定性。而相比传统的插入式电极刺激，光遗传学能够对特定类型的神经细胞进行非侵入式的刺激。基于这些优点，光遗传学备受神经科学研究者们的青睐，被广泛应用于神经环路和脑疾病的研究中。

虽然对不同类型的细胞具有特异性，光遗传学却不一定能够对属于同一类型的细胞进行有选择性的刺激。当使用蓝光或绿光激发时，目标脑区中的很大一个三维区域都会被照射到，从而刺激到在该区域内所有属于某一特定类型的神经细胞。

由于这些细胞可能具有不同的功能，如果它们被无差异地刺激，研究者们将很难对神经环路的响应进行研究。为了实现高精度调控，我们有必要把光精准地投射到由研究者设定的目标细胞上，而非一整个区域。根据不同的应用需求，目标细胞可以是单一细胞，也可以是分布在三维神经环路中的一群指定细胞。这种在三维空间中可编辑的激发方式是传统显微镜无法实现的。

双光子全息显微镜可以克服上述这一难关。这里涉及两个技术。

第一，双光子激发（名词解释>>>）。它具有光学切片（名词解释>>>）能力：由于双光子的激发效率和光强的平方成正比，这使得双光子激发效率在聚焦区域达到顶峰，而在聚焦区域之外迅速减弱。同时，双光子激发使用近红外光，在生物样品中的光散射较弱，可以高质量地聚焦到样品比较深的区域。

第二，光全息技术（名词解释>>>）。通过一个空间光调制器（名词解释>>>），光全息技术可以把激发光分解并聚焦到三维空间中的多个区域。把双光子激发和光全息技术结合起来，就可以同时对分布在三维空间中的多个目标神经细胞进行刺激，而不直接影响到它们周围的细胞。通过快速切换光全息图，不同的目标细胞群可以依次被刺激到。所以双光子全息显微镜同时具有很高的空间和时间分辨率。

图：通过空间光调制器构建三维全息投射。[W. Yang, et. al, Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current Opinion in Neurobiology 50, 211-221 (2018)]

图：双光子全息显微镜在荧光样品中的三维投射例子。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

杨暐健博士及其合作者是最早把双光子全息光遗传学应用到活体小鼠大脑中，实现对在三维空间中的一组神经细胞进行刺激，并同时记录其活动的团队之一。在此之前，双光子全息光遗传学仅仅被应用在小鼠大脑切片中，又或是活体小鼠大脑的单一切面中。

杨暐健博士将此技术推广到三维大脑空间，他的双光子显微镜有两大特点：

1. 该显微镜拥有两个光路，把双光子三维高速钙离子成像（名词解释>>>）和双光子三维全息光遗传学结合起来，实现对神经活动的同时读写。其中一个光路实现钙离子成像，对神经活动进行记录。另外一个光路实现全息光遗传学，对神经活动进行调控。通过在钙离子成像光路中设置一个电调焦透镜，显微镜可以高速记录在不同深度的神经细胞活动。通过这一神经活动图，研究者们可以选定目标神经细胞，并把它们的空间位置编码到空间光调制器中，从而在样品中生成三维全息投射并刺激目标神经细胞。为了避免“读”和“写”的相互串扰，两光路使用不同波长的光，可以独立激发对应的钙离子探针和光敏离子通道。

2. 该显微镜可以同时刺激多个神经细胞，但又要避免使用过高的激光能量而在大脑中产生过多热量。为了实现这一目标，该显微镜使用低重复频率的飞秒激光器作为光遗传学的双光子光源。相比在双光子显微镜中普遍使用的高重复频率飞秒激光器，低重复频率飞秒激光器有很高的单脉冲能量，从而在保持低平均功率的情况下大大提高了双光子激发效率。利用这一优点，该显微镜可以用比较低的激光功率同时刺激近百个神经细胞。

图：通过双光路显微镜对小鼠大脑神经活动的高精度记录和调控。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

双光子全息光遗传学可以把信息精确地写入大脑中，这为调控大脑活动和动物行为提供了一个有力工具。在2019年《Cell》的一篇论文中，杨暐健博士及其合作者证实了对小鼠视觉皮层神经细胞的精确调控可以模拟小鼠的视觉感知，并触发其行为。换句话说，视觉信息无须通过眼睛进入大脑，而可以被双光子全息光源直接写入到大脑，使小鼠 “感知” 到真的视觉刺激。除此以外，双光子全息光遗传学还可以对大脑进行编程。多个实验室证实，如果在激发一组大脑神经细胞的同时给予小鼠奖励，那么小鼠可以学会把这组神经细胞的活动和奖励联系起来。这相当于人工建立了一个神经活动和动物行为的新链接。

正如杨暐健博士在其《Science》的获奖论文中提及：双光子全息显微镜把光遗传学带入到一个崭新的精准时代。展望未来，双光子全息光遗传学将继续在基础神经科学中发挥重大作用，也有望在精准医学中大展身手。

论文信息

Yang W, Carrillo-Reid L, Bando Y, Peterka DS, Yuste R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018).

https://doi.org/10.7554/eLife.32671

Yang W, Yuste R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current opinion in neurobiology 50, 211-221 (2018).

https://doi.org/10.1016/j.conb.2018.03.006

Carrillo-Reid L, Han S, Yang W, Akrouh A, Yuste R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell 178, 447-457.e5 (2019).

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.045

Yang W, Manipulating neuronal circuits, in concert. Science 373, abj5260 (2021).

https://doi.org/10.1126/science.abj5260

编辑 | 赵阳

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