【学术前沿】12篇同时发出，陆发隆等人在冷门基础科学领域取得一系列原始创新，全面打开RNA调控研究…

身处信息爆炸的时代，你对于一些科研“明星”词汇绝对是耳熟能详，比如：干细胞、iPS、m6A、CRISPR/基因编辑、DNA甲基化、组蛋白修饰、单细胞测序、相变、衰老、跨代遗传等。但是，你听说过RNA poly(A) 尾巴吗？可能很多人对 poly(A) 尾巴的印象仅限于教科书中描写的：“真核生物mRNA大都具有poly(A)尾巴”。

1971年Edmonds就发现mRNA具有poly(A)尾巴1，它是RNA转录后在其3'末端，通过非模板方式，由多种调控因子/酶添加的一连串的碱基，这些碱基绝大部分是A。poly(A)尾巴是绝大多数真核生物mRNA和长链非编码RNA的必要结构组分，对于RNA的转运、稳定性、翻译等至关重要。然而，poly(A)尾巴的研究一直不温不火，甚至一度被冷落。

造成poly(A) 尾巴被冷落的根本原因之一还是检测手段的落后：常规的DNA或RNA序列很容易通过二代高通量测序技术检测，但是，poly(A)尾巴是由同聚物组成的，因此其很难被二代测序准确地检测。虽然有TAIL-seq2、PAL-seq3等技术，但是这些都是基于二代测序估算poly(A)长度，需要对测序仪软件和测序程序进行改造，且技术本身的要求非常高，一般实验室很难采用这些方法。另外，这些技术对材料量的要求都很高，对于微量样品（哺乳动物的卵或胚胎，尤其是人卵和胚胎）几乎无法检测。

随着科技进步，三代测序PacBio对同聚物的检测优势远远高于二代和Nanopore，可以准确地检测同聚物，借助于这一优点，在2019年，中科院遗传发育所陆发隆实验室和德国Nikolaus Rajewsky实验室同时开发了检测poly(A)尾巴的新技术，分别为PAIso-seq14和FLAM-seq5。这两种方法都可以准确分析poly(A)尾巴长度及碱基组成。令人惊讶的是：poly(A)内部并不是此前认为的纯A序列，含有大量的非A碱基，这让陆发隆实验室敏锐地意识到poly(A)尾巴不再是人们以前认识到的poly(A)尾巴，而是具有更复杂更有意义的广泛的调控功能组件。

然而，FLAM-seq的起始RNA量需要微克级别，且无法检测末端非A碱基和短或无poly(A)尾巴的转录体；PAIso-seq1也无法检测末端非A碱基和短或无poly(A)尾巴的转录体，但是PAIso-seq1有一个非常好的优点：其灵敏度很高，甚至可以做到单个细胞水平的poly(A)尾巴检测。

随后，为了弥补PAIso-seq1技术的缺陷，陆发隆实验室联合东北农业大学王加强实验室又开发了PAIso-seq2技术，这一技术可以很好地弥补PAIso-seq1技术的缺点。PAIso-seq2可以检测任何位置的非A碱基，也可以捕获到很短甚至无poly(A)尾巴的转录体，PAIso-seq2有一个很大的缺点，就是低灵敏度，对RNA起始量要求高，然而，这一缺点正好被PAIso-seq1技术弥补了。

“工欲善其事，必先利其器”。随后，这两个实验室利用自己开发的PAIso-seq1和PAIso-seq2两种互补的技术对小鼠、人、大鼠、猪四个物种的卵子和着床前早期胚胎、小鼠的各个组织、10个物种、不同细胞系样品进行了poly(A)尾巴相关的深入研究。在这近两年的时间里，他们发现了一系列令他们自己都震惊的poly(A)尾巴相关的生物学现象和功能，其中有很多发现，都是一开始万万没想到的。这些原创性的研究成果将为分子生物学领域最基础的研究开辟一条新的道路，poly(A)尾巴的组成、长度、调控及功能的揭示，将给各种生物学过程的研究带来全新的启示。

最近，他们将这两年的发现，整理成了12篇文章，放在了bioRxiv上。主要发现如下：

1、Comprehensive analysis of mRNA poly(A) tail reveals complex and conserved regulation6

PAIso-seq2技术（可以完整捕获整个转录组的3’末端，不受3’末端poly(A)尾巴的状态影响）：1)完整poly(A)尾巴序列，没有3’末端序列选择性偏好，可以捕获任意类型的RNA 3’末端；2)可以同时准确检测poly(A)尾巴5’末端、内部以及3’末端的非A碱基；3)可以在检测poly(A)尾巴的同时检测全长RNA isoform，获取其可变剪切和可变加尾位点信息；4) poly(A)尾巴长度检测没有上限；5)无需进行poly(A)+ RNA富集，极大地减少了富集导致的poly(A)尾巴长度和碱基组成偏差。因此该技术是最全面的全转录组包含poly(A)尾巴在内的RNA 3’末端测序技术，为这里其他的研究奠定了基础。并且该研究通过分析细胞核与细胞质mRNA的poly(A)尾巴差异证明了该技术的应用潜力。

2、Abundant non-A residues in the poly(A) tail orchestrate the mouse oocyte-to-embryo transition7

小鼠卵子向胚胎转换过程中非A碱基动态与调控：如m6A这种已知丰度最高的RNA化学修饰在总转录本中所占百分比也只是个位数，但是该研究发现在受精卵中，含有非A碱基的poly(A)尾巴（可以理解为对poly(A)尾巴的一种修饰，通过掺入不同的碱基实现）占比高达40%-90%！是分析数据之前完全意料不到的，相信也是所有人在看到这篇文章之前意料不到的。该工作将使得人们真正开始去认识poly(A)尾巴的调控功能：非A碱基的位置、数量、不同碱基以及尾巴长度这几个参数排列组合，能够组成一个复杂的poly(A)尾巴密码，调控mRNA的命运与功能。相信这个研究能够真正开启poly(A)尾巴非A碱基修饰调控领域，如同当年David Allis证明组蛋白乙酰化调控转录一样。

3、Poly(A) tail length is a major regulator of maternal gene expression during the mammalian oocyte-to-embryo transition8

小鼠卵子向胚胎转换过程中poly(A)尾巴长度的动态、调控与功能：该研究的发现给出了哺乳动物卵子成熟过程中全转录组的poly(A)尾巴长度调控翻译效率的答案，并且阐明了Btg4如何通过调控去尾来控制母源RNA降解。在此基础之上，还取得了以下意想不到的发现：1)在哺乳动物（小鼠，大鼠，人，猪）卵子成熟过程中mRNA的不同APA isoform有不同的poly(A)尾巴调控，APA distal isoform比proximal isoform有更长的poly(A)尾巴；2)在四个哺乳动物物种中受精之后都发生了大量的全局性重新加尾过程，这些重新加尾的母源RNA可以支持翻译，并且是胚胎继续发育所必须的。此研究回答了领域里大家都关心的问题，并且取得了意想不到的重要新发现。

4、Re-polyadenylation occurs predominantly on maternal mRNA degradation intermediates during mammalian oocyte-to-embryo transition9

小鼠、人、大鼠、猪四个物种中在卵子向胚胎转换过程中重新加尾主要发生mRNA在降解中间体上：工作2和3中发现在哺乳动物卵子和受精卵中发生全局性重新加尾以及非A碱基修饰生成。该工作中证实在小鼠、大鼠、人、猪四个物种中全局性重新加尾主要发生在完全去尾，并在3’-UTR上发生部分降解的mRNA转录本上，这种在mRNA部分降解的3’-UTR重新加尾转录本在受精卵中占所有poly(A)+ mRNA的60%以上。从而揭示了在卵子和早期胚胎中独特的mRNA通过poly(A)尾巴进行的转录后调控。

5、Dynamics of poly(A) tail length and non-A residues during the human oocyte-to-embryo transition10

人卵子向胚胎转换过程中poly(A)尾巴长度与非A碱基动态与调控：从鱼，两栖类，小鼠的卵和胚胎研究中，人们相信poly(A)尾巴介导的转录后调控在人卵子成熟和早期胚胎发育中一定起着重要的作用。但是由于样品稀少，技术灵敏度受限，目前对人卵和胚胎中的poly(A)尾巴的状态和功能完全未知，一个基因的都不知道。该工作实现了全转录组范围的poly(A)尾巴动态变化（包括长度以及非A碱基）与调控的解析，是里程碑性的突破，使得从这个角度研究人类生殖从不可能变成可能。

6、Maternal mRNA deadenylation is defective in in vitro matured mouse and human oocytes1

体外成熟卵子全局性母源mRNA去尾障碍：卵子体外成熟是辅助生殖重要技术手段，然而体外成熟卵子来源胚胎发育效率较体内成熟卵子来源的胚胎低。该研究发现在正常体内成熟卵子中发生的全局性母源mRNA去尾在体外成熟卵子中存在障碍。并且机制上可能是由于促进母源mRNA去尾酶与调控因子的翻译激活（通过poly(A)尾巴延长进行翻译激活发生缺陷）受抑制。

7、Conservation and divergence of poly(A)- tail regulation during the mammalian oocyte-to-embryo transition12

大鼠和猪在卵子向胚胎转换过程中和小鼠与人的异同：在小鼠和人的卵和胚胎中看到了poly(A)尾巴介导的转录后调控总体是保守的，也有部分两个物种之间不一样的。因此，该研究又增加了两个代表性的模式物种，大鼠和猪来研究上述新发现在进化上的保守性。研究发现卵子成熟和早期胚胎中总体的poly(A)尾巴长度变化包括先全局性去尾，之后再重新加尾是在四个物种中保守的；大量非A碱基的生成是保守的。然而在受精之后非A碱基转录本稳定存在的时间体现出明显的物种特异性，与其物种特异的合子基因组激活时间相关。同时该研究有两个额外发现：1)孤雌激活的胚胎中表现合子基因组激活以及母源RNA去尾异常，表明精子来源物质在此过程中起重要作用；2)合子基因组激活是母源RNA去尾所必须的，表明合子基因组激活产物促进了母源RNA的去尾与降解。

8、Enhancement of synthetic mRNA translation efficiency through engineered poly(A) tails13

Poly(A)尾巴内部的非A碱基促进mRNA翻译：poly(A)尾巴是多数mRNA翻译所必须的，起初人们猜测非A碱基的掺入可能会降低poly(A)尾巴支持翻译的功能，然而研究结果表明与起初猜测正好相反，非A碱基的掺入可以促进而非抑制mRNA的翻译，这一发现有着无限的应用价值，可以适用于所有基于mRNA的治疗和疫苗应用，可以用更低剂量的mRNA实现更高的蛋白表达产物，能降低mRNA临床应用的成本，提高产能，并提高安全性，具有突破性的生物技术应用价值。

9、Interactions between RNA m6A modification, alternative splicing, and poly(A) tail revealed by MePAIso-seq214

MePAIso-seq2技术：将PAIso-seq2进一步与m6A RNA免疫共沉淀结合，可以在一条mRNA上同时研究m6A修饰、可变剪切、可变poly(A)加尾位点、poly(A)尾巴长度和poly(A)尾巴中非A碱基修饰。通过该技术，对细胞系中m6A的修饰与可变剪切、可变加尾、poly(A)尾巴长度和非A碱基进行了联合分析。发现：1) m6A修饰影响多种可变剪切形式；2)对加尾位点选择的影响在不同细胞系中有不一样的影响；3)非常有意思的是m6A修饰的mRNA拥有明显更长的poly(A)尾巴，其中有较少的非A碱基的掺入。为研究mRNA上化学修饰、可变剪切、可变加A、poly(A)尾巴长度与非A碱基之间的相互关系提供了低门槛，简单易行，可重复性好的研究工具。

10、Dynamics of mitochondrial mRNA abundance and poly(A) tail during the mammalian oocyte-to-embryo transition15

哺乳动物卵子向胚胎转换过程中线粒体mRNA经历完全不同的调控：在上述研究的小鼠，大鼠，猪和人四个物种卵子向胚胎转换过程中细胞核编码RNA的poly(A)尾巴经历着巨大的长度与非A碱基的动态调控。神奇的是，线粒体mRNA poly(A)长度非常稳定，在不同组织、不同物种间非常一致。线粒体转录的mRNA poly(A)的非A碱基含量在不同组织间略有差异，在卵子到胚胎转换过程中略微升高。此外，线粒体mRNA的表达水平在不同组织之间差异很大，并且在卵子到胚胎转换过程中显著升高。表明线粒体和细胞核编码的mRNA经历着完全不同的调控。

11、Mitochondrial mRNA is a stable and convenient reference for the normalization of RNA-seq data16

线粒体mRNA可以作为转录组分析的很好的归一化内参：由于上述研究发现线粒体在不同样品（配子，胚胎，体细胞）中的poly(A)尾巴超级稳定，因此，作者提出线粒体编码的mRNA可以用作稳定且方便的转录组样品间比较的归一化内参。通过实际的RNA-seq数据，并与外源添加spike-in做比较证实了上述猜想。该方法已经被用在前面研究卵和胚胎的PAIso-seq1数据分析中。更重要的是该方法将在所有的转录组分析中有广泛的应用前景。

12、Degradation intermediates as an indicator of mRNA and cell metabolism17

mRNA降解中间体比例是mRNA和细胞代谢速率的好的指标：通过PAIso-seq2检测发现不同的基因的3’末端无poly(A)尾巴的降解中间体比例是mRNA的稳定性，细胞周期长短，组织代谢速度的非常好的指标。为研究mRNA、细胞甚至组织的代谢速率提供了好的方法，有着广泛的应用前景。

据悉，这些工作主要是由一个合作团队共同完成的，团队的主要成员有5人，分别为：陆发隆博士、王加强博士、刘玉胜博士、聂虎博士和硕士研究生张轶伟。每个人都承担了各自的工作：聂虎和张轶伟主要负责具体的生信分析；刘玉胜主要负责绝大部分实验（包括取材、显微注射、分子相关实验、细胞相关实验、PAIso-seq1和2建库等其它实验）、12篇文章的所有figure的设计和整理；王加强主要负责poly(A)尾巴定义pipeline的建立、完成了12篇文章的所有模式图和数学模型；陆发隆主要负责指导与核对聂虎和张毅伟的生信分析。文章的写作主要是由陆发隆和王加强执笔，刘玉胜辅助完成。另外，中科院动物所李伟团队提供了相关实验技术帮助，周兵团队提供了生信分析帮助，山东大学陈子江赵涵吴克良团队提供了符合伦理的人卵和胚胎的相关实验材料以及实验处理，所有的胚胎样本来源于捐献于研究的临床上无使用价值的不成熟卵子。

值得一提的是，刘玉胜博士一直潜心于RNA转录后调控的相关研究，主要围绕着哺乳动物卵和早期胚胎去腺苷酸化介导的母源mRNA降解的调控机制开展相关工作。2016年，他和另外两个实验室一起发现了第一个哺乳动物母源mRNA降解调控因子BTG418-20 (JMCB )；2019年，建立了可以在单个细胞水平进行poly(A)尾巴测序的新技术PAIso-seq14(Nature Communications )；2020年发现在体细胞中相比于poly(A)长度，非A碱基随着细胞周期的进行呈现出高度动态的变化21 (iScience )；如今，刘玉胜博士又作为第一作者完成了上述12篇poly(A)相关文章。刘玉胜博士从研究生入学到现在，正好十年，十年磨一剑，终于迎来如今的厚积薄发。

参考文献

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[7]Liu, Y. et al. Abundant non-A residues in the poly(A) tail orchestrate the mouse oocyte-to-embryo transition. bioRxiv, doi:10.1101/2021.08.29.458077 (2021).

[8]Liu, Y. et al. Poly(A) tail length is a major regulator of maternal gene expression during the mammalian oocyte-to-embryo transition. bioRxiv, doi:10.1101/2021.08.29.458052 (2021).

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[15]Liu, Y., Zhang, Y., Liu, Z., Lu, F. & Wang, J. Dynamics of mitochondrial mRNA abundance and poly(A) tail during the mammalian oocyte-to-embryo transition. bioRxiv, doi:10.1101/2021.08.29.458072 (2021).

[16]Liu, Y., Zhang, Y., Lu, F. & Wang, J. Mitochondrial mRNA is a stable and convenient reference for the normalization of RNA-seq data. bioRxiv, doi:10.1101/2021.08.29.458063 (2021).

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[19]Pasternak, M., Pfender, S., Santhanam, B. & Schuh, M. The BTG4 and CAF1 complex prevents the spontaneous activation of eggs by deadenylating maternal mRNAs. Open biology 6, doi:10.1098/rsob.160184 (2016).

[20]Yu, C. et al. BTG4 is a meiotic cell cycle-coupled maternal-zygotic-transition licensing factor in oocytes. Nat Struct Mol Biol 23, 387-394, doi:10.1038/nsmb.3204 (2016).

[21]Liu, Y., Nie, H. & Lu, F. Dynamic RNA 3' Uridylation and Guanylation during Mitosis. iScience 23, 101402, doi:10.1016/j.isci.2020.101402 (2020).

来源：iNature

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原标题：《【学术前沿】12篇同时发出，陆发隆等人在冷门基础科学领域取得一系列原始创新，全面打开RNA调控研究的一扇新大门！》

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