水相无保护——多肽/蛋白结构中半胱氨酸位点选择性糖基化修饰

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糖基化修饰是一种重要的蛋白/多肽翻译后修饰，对蛋白质的构象和功能以及抗体、多肽类药物的药效起到了关键的调控作用。因此，关于蛋白/多肽的糖基化修饰方法研究一直备受关注。北京大学叶新山及其合作者利用糖基硫代硫酸盐（Bunte Salt）作为糖基供体，实现了水溶液中、无保护条件下多肽/蛋白结构中半胱氨酸位点的选择性糖基化修饰，并研究了糖基化类型对胰高血糖素样肽-1（GLP-1）体内稳定性的影响。

研究不同糖基化类型对多肽/蛋白质类药物活性的影响规律，不仅可以帮助我们深入理解药物的作用机制和构效关系，而且可以指导我们对现有药物进行分子改造，以延长半衰期和提高药效。为此，必须首先获得结构均一的糖肽/糖蛋白分子。一般而言，人工化学合成是获得结构均一的、修饰不同糖链的多肽/蛋白类药物的最有效手段。

与常规糖化学反应不同，蛋白/多肽的糖基化必须足够温和，才能保持底物的结构稳定性和固有生理活性。因此，蛋白的化学修饰一般要求在水溶液中、室温或低温环境、生理pH条件下进行；同时，还需要实现特定氨基酸位点的选择性修饰，才能获得结构均一的修饰产物。在此背景下，英国牛津大学的Davis课题组首先提出了利用多肽/蛋白结构中的半胱氨酸（Cys）位点进行选择性糖基化修饰的策略（Acc. Chem. Res., 2011, 44, 730-741）。

利用半胱氨酸位点进行选择性糖基化修饰具有以下几个优点：1）Cys上的巯基相较于其它氨基酸残基具有更高电负性，更容易发生亲核取代反应；2）Cys在肽链结构中的自然丰度比较低，更容易实现定点修饰，且对于不含Cys的肽链或蛋白，可以通过定点突变的方式引入Cys；3）通过巯基反应得到的硫连接糖苷键具有更高的酶解稳定性，往往可以赋予糖蛋白或糖肽更高的活性。

图1

但是，之前的糖基化修饰方法也存在一些不足之处。例如：糖基供体的制备要经历多步保护-脱保护的繁琐操作，需要使用大量的有机溶剂，尤其对于分子量较大的寡糖和含唾液酸结构的糖链操作更加困难；对于一些反应活性较低的寡糖的修饰效率往往很低；糖基化修饰反应后还会产生很多环境不友好的有机物，原子经济性较低（图1a）。

为了解决上述问题，北京大学药学院叶新山等人利用糖基硫代硫酸盐（Org. Lett. 2018, 20, 76-79.）作为新的对Cys进行选择性反应的糖基供体，它可以实现水溶液中糖基无保护条件下的一步合成，无需任何保护基操作，避免了有机溶剂的使用，符合绿色化学的要求。同时，该反应也适用于唾液酸寡糖等复杂的糖链结构供体。在后续Cys偶联反应中，通过弱碱性条件下的简单混合就可以实现，且产生的唯一副产物是无毒的无机盐，原子经济性较高（图1b）。利用该方法，他们实现了在多肽和蛋白质底物上多种糖型温和条件下的定点糖基化修饰。

图2

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种治疗糖尿病的候选药物，但其半衰期太短。利用该策略，作者重点对18位氨基酸位点Cys突变的GLP-1进行了不同种类的糖基化修饰，并通过小鼠血糖实验验证了糖基化修饰对GLP-1体内半衰期的影响，结果发现只有N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）修饰延长了GLP-1的半衰期，其它类型的糖基化修饰并不能提高GLP-1的体内稳定性（图2）。同时，该结果还验证了通过二硫键的方式进行糖基化修饰可以代替氧苷糖基化修饰，可以达到改善多肽药物稳定性的目的。此项研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发项目以及北京市卓青项目的资助。该工作以Communication的形式发表在CCS Chemistry，已在官网“Just Published”栏目上线。

文章详情：

Protection-Free Site-Directed Peptide or Protein S-Glycosylation and Its Application in the Glycosylation of Glucagon-like Peptide 1

Gefei Li, Yuankun Dao, Juan Mo, Suwei Dong, Shin-ichiro Shoda and Xin-Shan Ye*Cite this: CCS Chem. 2021, 3, 2316–2323

文章链接：https://doi.org/10.31635/ccschem.021.202101115

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原标题：《水相无保护——多肽/蛋白结构中半胱氨酸位点选择性糖基化修饰》

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