【科技前沿】专家点评：张毅/庄小威合作通过单细胞测序和MERFISH构建系统的伏隔核单细胞图谱

结构决定功能是生物学的基本原则之一。解析神经系统的细胞构成及不同细胞类型的空间分布是理解神经系统功能的基础，也是目前神经科学研究的热点之一。伏隔核 (nucleus accumbens, NAc) 作为基底神经节的重要组成部分，通过整合皮层和边缘系统的输入信息，参与如奖赏/厌恶，动机，社交行为，学习等在内的多种行为调控。伏隔核的功能异常会引起多种神经系统疾病，如抑郁、焦虑、精神分裂症、成瘾等。

尽管人们对伏隔核功能和解剖的复杂性已有相当了解，但其细胞学机制仍有待进一步阐明。伏隔核中90%以上的神经元为表达多巴胺1型受体和2型受体 的中型多棘神经元 (分别称为D1 MSN及D2 MSN)。根据目前被广泛接受的“二分法”直接/间接通路模型(direct/indirect pathway model)，纹状体 (striatum, 包含背侧纹状体、伏隔核、嗅结节) 中的D1和D2 MSN分别形成直接和间接通路，具有不同的投射与功能。尽管这一模型从整体水平解释了纹状体的细胞-环路-功能关系，但其并未考虑到纹状体内部的异质性，因而无法很好的解释伏隔核结构与功能的复杂性。最近的几项研究表明D1 和 D2 MSN内部存在相当水平的基因表达异质性，且MSN的基因表达与其在纹状体内空间分布存在相关性【1-3】。但是，由于实验手段的限制，兼具基因表达和空间分布信息的伏隔核细胞图谱仍未被建立，不同细胞亚类对伏隔核结构与功能复杂性的贡献仍不明确，这阻碍了对伏隔核相关功能和疾病机制的进一步研究。

2021年10月18日，哈佛医学院波士顿儿童医院张毅实验室和哈佛大学庄小威实验室合作在Nature Neuroscience杂志以Resource的形式发表了题为Decoding molecular and cellular heterogeneity of mouse nucleus accumbens 的研究，使用单细胞测序和MERFISH (multiplexed error-robust FISH) 技术构建了小鼠伏隔核细胞图谱，在详细解析不同MSN亚类基因表达和空间分布的基础上，对这一脑区的细胞-结构-功能关系提供了更深入的认识。

研究人员首先对成年小鼠的伏隔核区域进行了单细胞测序分析，区分出D1 MSN、D2 MSN、中间神经元等主要细胞类型。在此基础上，进一步对以上三群神经元进行详细分类 (图1)，鉴定出8个D1 MSN亚类 (可进一步细分为30个亚类)、8个D2 MSN亚类 (可进一步细分为27个亚类) 和13个中间神经元亚类。结合荧光原位杂交并参考Allen Brain Atlas中的原位杂交数据，研究者们发现富集在不同神经元亚类中的基因呈现出不同的空间分布特征，提示这些神经元亚类的基因表达与其空间分布相关，这可能是伏隔核结构/功能复杂性的细胞基础。图1. 根据单细胞RNA测序数据划分的MSN亚类及它们的空间分布

由于无法直接从单细胞测序数据中提取细胞的空间分布信息，研究者筛选了253个基因 (包含不同细胞类型和神经元亚类的标志基因及神经系统功能相关基因如通道，神经肽，受体等)，使用MERFISH技术分析了它们在伏隔核切片中的表达，其检测到的基因表达水平与RNA测序数据呈现高度正相关。进一步比较基于MERFISH和单细胞测序数据定义的细胞类型，结果显示在主要细胞类型和MSN亚型的水平上，两种方法均表现出很好的一致性。

图2. 根据MERFISH数据划分的MSN亚类及它们在纹状体中的分布

在根据MERFISH数据划分MSN亚类后，研究人员进一步分析了不同MSN亚类的空间分布特征，发现这些特征与已知的纹状体结构复杂性高度相关，且在伏隔核内发现了之前未被报道的结构异质性 (图2)。例如，依据MSN亚类间的临近位置关系进行聚类，可将其分为若干大群，对应于纹状体内的主要分区。而根据伏隔核内不同MSN亚类的空间分布，可将其大致分为前部 (anterior part) 和后部的核 (core) 及壳 (shell) 区域。尽管伏隔核的核/壳结构被广泛接受，但之前的研究无法准确定义核/壳区域，仅根据大致的解剖学结构对其加以区分。本研究发现不同的MSN亚类高度富集于核或壳区域，提示这可能是区分核/壳的细胞学基础 (图3)。有趣的是，在核或壳区域内部，不同的MSN亚类仍表现出广泛的空间分布异质性。例如，在内侧壳 (medial shell) 区域，多个MSN亚类沿背腹轴分布，而在核区域，不同MSN亚类偏向于腹内侧或背外侧 (ventromedial/dorsolateral)。以上结果表明，不同MSN的空间分布特征可能是纹状体和伏隔核结构复杂性的细胞学基础。那么，不同的MSN亚类是否与伏隔核的功能多样性存在关系呢？研究者们从以下三方面进行了分析：首先，不同MSN亚类的空间分布特征，与已知的伏隔核亚区域功能多样性相吻合；第二，与神经系统功能相关的基因 (如阿片受体)，表现出高度的细胞和空间分布特异性；第三，不同神经元亚类的基因表达与空间分布特征提示在伏隔核内存在细胞类型依赖和亚区域特异的细胞间相互作用。以上发现表明，伏隔核内不同神经元亚类的基因表达和空间分布特征至少部分构成了这一区域功能复杂性的细胞和分子机制。

图3. MSN亚类在核/壳亚区域的空间分布

总的来说，该研究通过单细胞测序和MERFISH这两种互补的高通量分析方法构建了小鼠伏隔核的分子/细胞图谱，在单细胞水平上系统研究了这一区域神经元亚类的基因表达和空间分布特征，从而回答了一个长期存在的问题：伏隔核如何通过看似简单的神经元构成 (D1/D2 MSN) 实现其复杂的结构与功能 。这一基本的分子-细胞-结构-功能关系框架的建立，能够从多方面促进伏隔核结构与功能的研究：第一，解析不同神经元亚类的转录特征能够为构建新的研究工具 (如转基因动物、病毒工具) 提供依据；第二，了解不同神经元亚类的基因表达和空间分布信息有助于将现有和未来关于伏隔核的研究整合到同一的框架中，包括神经连接，神经元活性，神经元功能等；第三，揭示伏隔核内之前未知的分子和细胞异质性，为进一步探索其功能多样性提供了新的研究方向。

这一研究由哈佛医学院波士顿儿童医院张毅实验室和哈佛大学庄小威实验室合作完成。陈任超博士，Timothy R. Blosser博士和Mohamed N. Djekidel博士为该研究的共同第一作者。张毅教授和庄小威教授为共同通讯作者，均为HHMI研究员。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41593-021-00938-x

专家点评

王晓群（中科院生物物理所）

伏隔核是一个位于基底前脑的重要核团，它是腹侧纹状体的重要组成部分，包含大量的中型多棘GABAergic投射型神经元，是中枢神经系统中主要的抑制性神经元类型。伏隔核参与构成基底神经环路，在奖赏、成瘾、恐惧和强化学习等活动中起到重要的调控作用。过去，解剖学和功能学的研究表明伏隔核与其他大脑区域有着复杂的神经连接，参与形成多个重要的神经环路，但其中的细胞类型和分子特征以及不同神经元亚型的空间分布仍不清楚。

张毅教授通过单细胞RNA测序技术系统地解析了小鼠伏隔核脑区的细胞类型，发现了D1/D2两种类型的中型多棘GABAergic神经元，并将其分为了多种亚型，然后通过与庄小威教授合作， 利用MERFISH技术确定了这些神经元亚型在伏隔核脑区不同位置的空间分布，并通过综合分析这些神经元亚型的分子表达和空间特征，从而将不同神经元亚型和不同功能联系起来，阐明了伏隔核内细胞类型及分子特征、神经元的空间位置和功能的相互关系。

张毅教授的工作填补了伏隔核脑区高分辨率的细胞分子图谱和神经元亚型的空间图谱的空白，为我们更好地理解伏隔核的细胞组成、分子特征及功能提供了非常重要的信息。

此外，近些年来，随着对大脑研究的深入，越来越多的证据表明，想要真正系统地阐明大脑核团的功能和工作机制，了解其内部的细胞类型尤其是神经元的亚型及其空间位置的分布是必不可少的，而该研究也为这方面的研究提供了一种基于细胞分子特征-神经元的空间分布-脑区功能的新思路，对脑的功能研究起到了一定的指导和示范作用。

张毅教授与庄小威教授都是华人科学家里令人十分尊重的教授，两人强强联手，共同为研究脑功能的新范式开发出了一个新思路。张毅教授多年来，扎根表观遗传学，是该领域的领军人物。他最近几年分出一部分精力进军神经领域，在起步阶段选择了单细胞技术为突破口，是一个非常聪明的选择，也是一个利用数据驱动、研究脑功能的尝试。我个人非常了解张毅教授的这个转向过程，在投身神经领域的早期，张毅教授碰到了一些困难，特别是传统神经科学家的不理解，最近几年，随着研究的推进，张毅教授的工作越来越扎实、深入，预祝张毅教授在神经科学，走出一片新天地。

参考文献

1. O. Gokce et al., Cellular Taxonomy of the Mouse Striatum as Revealed by Single-Cell RNA-Seq. Cell reports 16, 1126-1137 (2016).

2. G. Stanley, O. Gokce, R. C. Malenka, T. C. Sudhof, S. R. Quake, Continuous and Discrete Neuron Types of the Adult Murine Striatum. Neuron 105, 688-699 e688 (2020).

3. A. Saunders et al., Molecular Diversity and Specializations among the Cells of the Adult Mouse Brain. Cell 174, 1015-1030 e1016 (2018).

本文转载自公众号“BioArt”（BioGossip）

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原标题：《【科技前沿】专家点评：张毅/庄小威合作通过单细胞测序和MERFISH构建系统的伏隔核单细胞图谱》

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