肺泡干细胞机械张力升高引起进行性肺纤维化

原创 医学参考报 干就有未来 

撰文│徐海斌

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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【据《Cell》2020年1月报道】题：肺泡干细胞机械张力升高引起进行性肺纤维化（作者Nan Tang 等）

肺纤维化特征是肺泡周围成纤维细胞过度增殖，在肺内生成的细胞外基质过度沉积，最终导致肺泡结构破坏，肺顺应性降低，并扰乱气体交换功能。最常见的肺纤维化类型是特发性肺纤维化（IPF），它始于外围区域的微小纤维化改变，并慢慢向内发展，这种纤维化最终导致呼吸衰竭，IPF是一种致命疾病，从确诊到中位生存期只有2～4年。尽管研究表明肺泡Ⅱ型（AT2）细胞参与了肺间质纤维化从外周到中心的进展，但其机制知之甚少。

肺泡上皮由肺泡Ⅰ型（AT1）和AT2细胞组成。AT2细胞是肺泡干细胞，在肺泡动态平衡和损伤修复过程中可分化为AT1细胞。AT1细胞属于鳞状细胞，是空气-血液屏障的上皮成分。在IPF组织中，调节异常的AT2细胞通常位于成纤维细胞病灶附近，并且，IPF中经常出现影响AT2细胞功能的基因突变。此外，最近IPF分子图谱表明，转化生长因子β（TGF-β）信号通路在AT2细胞中被激活。这些证据表明AT2细胞在肺纤维化中的病理作用，但IPF中AT2生理失调的确切机制仍有待阐明。

清华大学生物科学研究所Nan Tang课题组发现，肺泡干细胞（AT2）中CDC42功能的丧失导致了从外周到中心的进行性肺纤维化。并进一步证明，肺部分切除（PNX）术后和未经治疗的老年小鼠中，Cdc42缺失的AT2细胞都不能再生新的肺泡，导致AT2细胞持续暴露在机械张力升高的环境中，机械张力升高会激活AT2细胞中的TGF-β信号环，从而推动肺纤维化从周围型向中心型发展。

研究人员首先在拉伸及未拉伸的硅膜上培养小鼠GFP+AT2细胞，发现在拉伸硅膜上AT2细胞形态发生改变，并且GTP-CDC42显著升高，在PNX术后5天及7天，小鼠肺裂解物中GTP-CDC42含量显著升高，结合研究人员前期发现的PNX后5天AT2细胞出现分化，因此推断Cdc42的激活为AT2细胞向AT1细胞分化必不可少。随后，研究人员构建了Sftpc-CreER、Cdc42F/+、Rosa26 -mTmG（对照组）及Sftpc-CreER、Cdc42F/-、Rosa26-mTmG（Cdc42-敲除模型），老龄鼠模型及PNX模型术后21天，小鼠肺组织免疫荧光提示在对照组中出现许多新形成的肺泡及新分化的AT1细胞，然而在Cdc42敲除模型中只有极少AT2细胞分化为AT1细胞，且没有形成新肺泡。另外，在Cdc42敲除的外周肺组织中肺泡平均直径显著大于同区域的对照组。这些结果表明在PNX术后及肺泡稳态环境（老龄）下，Cdc42敲除的AT2细胞无法分化为AT1细胞，因此无法再生新肺泡。

研究人员随后观察了受损的肺泡再生机制对小鼠的长期影响，发现部分Cdc42敲除小鼠在PNX术后30天出现体重显著下降及呼吸速率增加，超过70%的小鼠在PNX术后180天死亡，且在观察终点存在，这提示肺纤维化进展。羟脯氨酸及HE 显示PNX术后的Cdc42敲除小鼠的肺纤维化由外周向中心进展，并且在致密的纤维化组织中检测到高表达的Ⅰ型胶原，表达量与PNX术后时间成正相关，在终末期纤维化肺组织中观察到浸润的炎症细胞。另外，相较于对照组，Cdc42敲除的肺纤维化组织中大多数基质细胞表达PDGFRβ，并且这些PDGFRβ+细胞均高表达Ⅰ型胶原，但这些PDGFRβ+细胞并不都同时表达a-SMA、Desmin、NG2，这提示PDGFRn+细胞的异质性。这些a-SMA+、Desmin+及NG2+的基质细胞共同促进肺纤维化的发生。同样，在12个月老龄鼠中也发现了由外周向中心进展的肺纤维化现象。以上结果提示AT2细胞中的Cdc42基因缺失会在PNX术后及老龄鼠中导致IPF。

在PNX术后模型中，研究人员发现AT2细胞在邻近纤维区域聚集，并且通过透射电子显微镜观察发现在纤维化发生前，Cdc42敲除小鼠的AT2细胞极化性及与周围细胞的连接较对照组未出现改变。随后研究人员通过Ki67检测Cdc42敲除的AT2细胞与对照组在PNX术后的差异，发现在PNX术后5天及7 天，Cdc42敲除小鼠的AT2细胞增殖率下降，而在术后21天，AT2细胞的增殖活性较对照组上升，这提示异常增殖的AT2细胞导致了AT2细胞的聚集。因此，研究人员对AT2细胞进行单细胞测序，发现Cdc42敲除小鼠在PNX术后AT2-亚群Ⅰ细胞显著升高，并激活细胞骨架重塑及黏着斑形成相关基因，与人IPF中的AT2细胞相似。

以上结果提示Cdc42敲除小鼠的AT2细胞与肺纤维化密切相关，研究人员通过原子力学显微镜在体外测量未膨胀肺组织的硬度，发现PNX术后21天Cdc42敲除小鼠外周肺叶硬度增高。通过对比正常组及Cdc42敲除鼠的肺活量，发现在PNX术后1小时，两组肺活量均明显下降，PNX术后1天及14天即恢复到正常水平，此时肺泡在Cdc42敲除鼠中并未再生，这验证了肺泡压力升高先于肺纤维化出现的假设。随后研究人员构建硅假体植入模型限制肺的机械张力增加。在PNX术后14天植入硅假体，21天时相较于正常组，Cdc42敲除组中未形成新肺泡，但肺泡扩大的表型明显被硅假体改善，并且硅假体植入明显抑制肌动蛋白-细胞骨架调节基因的增加及AT2细胞相关基因的减少，这说明Cdc42敲除小鼠的肺泡机械张力增加造成了异常基因的表达。PNX术后180天，植入硅假体的Cdc42敲除鼠中极大降低了死亡率，肺中的羟基脯氨酸含量下降，组织肺纤维化减少，以上结论都说明机械张力在调节肺纤维化中的重要作用，减少肺泡机械张力能减轻进行性肺纤维化。

机械张力如何调节肺纤维化形成的相关通路？研究人员在AT2-亚群Ⅰ细胞中发现，Tgfb1显著上升，对AT2细胞进行静态拉伸会增加AT2细胞的杨氏模量，以及Tgfb1的表达。同样，在AT2细胞及Cdc42敲除小鼠PNX术后21天的肺组织裂解液中检测到了大量的总TGF-β配体。基于TGF-β信号通路在IPF中的作用，研究人员进一步发现拉伸的小鼠及人AT2细胞核中显著表达p-SMAD2，且能被TGF-β中和抗体阻断，这提示拉伸的AT2细胞分泌的TGF-β 配体激活了自身的TGF-β信号通路。以上结果说明升高的机械张力激活AT2细胞中的TGF-β通路（图1）。

图 1 AT2细胞中机械张力激活的TGF-β信号传导对于纤维化进展至关重要

研究人员随后通过检测不同压力下肺组织膨胀后的AT2空间分布，显示在高压下AT2细胞分布更不均匀，相较于肺中心区域，肺周围组织的AT2 细胞之间间隔更大，这说明增加的肺泡压力在扩大肺泡的同时，中心及外周区域的压力分布不均，外周肺泡组织会受到更大的拉伸力。WT 小鼠在30 cmH2O压力下通气，肺周边组织的AT2 细胞p-SMAD2表达显著提高，且较中心组织表达高。在Cdc42敲除鼠及对照鼠中进行假体干预实验，与对照组相比，未植入假体的Cdc42敲除鼠AT2细胞p-SMAD2阳性显著升高，并且多集中在肺组织周边区域，另外假体植入显著降低了Cdc42敲除鼠中p-SMAD2及TGFβ1的表达，这些结果都说明升高的机械张力以空间调节方式激活AT2细胞中的TGF-β信号。

既然升高的机械张力是通过TGF-β信号作用AT2 细胞，研究人员随即使用AAV2/9递送Tgfb1-shRNA 进入PNX处理的Cdc42敲除小鼠中，发现处理后的小鼠肺AT2细胞Tgfb1及基质细胞的Col1a1，Col1a2显著下降。随后研究人员构建Tgfbr2和Cdc42双敲小鼠，发现PNX术后21天AT2细胞的Tgfb1表达显著下降，相较于Cdc42敲除小鼠不到40% 的存活率，超过80%的双敲小鼠存活，双敲小鼠术后肺中只有少量纤维化。这些结果说明AT2细胞中的TGF-β信号通路对机械张力驱动的肺纤维化的进展非常重要。

在研究中，研究人员发现进行性肺纤维化与肺泡再生受损引起的机械张力升高之间有直接联系。缺乏Cdc42的AT2细胞不能分化成AT1细胞，因此不能在肺损伤后再生新肺泡。这种受损的再生能力导致AT2细胞暴露在持续升高的机械张力中，这在Cdc42基因缺失小鼠的AT2细胞中以空间方式激活了TGF-β 信号环，肺周围更多的AT2细胞激活了TGF-β信号。因此，AT2细胞中被激活的TGF-β信号环以一种空间调节的方式促进肺纤维化的进展，在外周区域开始增厚，然后向肺中心进发。最后研究人员证明降低肺泡的机械张力是治疗进行性肺纤维化的一种潜在的治疗方法。

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《医学参考报》干细胞与再生医学专刊

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