专家点评｜复旦徐彦辉团队揭示+1核小体调控转录起始的分子机制

作为基因表达调控的核心，转录起始过程发生在基因启动子区，通过染色质重塑复合物剔除核小体暴露出启动子, 允许转录起始复合物（preinitiation complex，PIC）的组装， 在中介体（Mediator）的帮助下组装成PIC-Mediator转录起始超级复合物。徐彦辉团队围绕人源转录起始机制研究取得了系列重要突破，部分成果入选2021年度中国生命科学十大进展。

PIC-Mediator是转录起始调控的核心，基因表达主要受转录因子和表观遗传调控。其中转录因子结合在增强子和启动子附近促进PIC-Mediator的招募和组装，而表观遗传对转录的调控集中在启动子下游的第一个核小体上（称为+1核小体）。与其他核小体不同，+1核小体含有组蛋白乙酰化和H3K4三甲基化修饰，特征性的组蛋白变体H2A.Z和H3.3。这些特征的形成受修饰酶和染色质重塑复合物动态调节，影响所在基因的表达水平，是表观遗传调控的核心。目前绝大部分模型显示转录复合物与+1核小体是分离的，+1核小体中组蛋白的柔性末端修饰可结合TFIID帮助PIC招募，同时转录机器进入延伸状态才遇到并绕过+1核小体。以往所有转录起始复合物结构都是基于DNA模板，无法展示+1核小体与转录起始复合物之间的结构功能关联性。

2022年10月7日，复旦大学生物医学研究院/复旦大学附属肿瘤医院徐彦辉课题组在Science杂志上在线发表题为 “Structures of +1 nucleosome–bound PIC-Mediator complex ”的研究论文。该项研究解析了包含+1核小体的PIC-Mediator复合物结构，首次展示了转录起始复合物与+1核小体的紧密结合，表明+1核小体对转录起始复合物在染色质上组装的重要调控作用（图1），建立了表观遗传和转录起始的直接关联。

结合+1核小体的PIC-Mediator结构

以往的测序研究表明，多数+1核小体位于基因转录起始位点（TSS）下游约40 bp处。受这一现象启发，研究团队构建了包含核小体和启动子的模板，根据核小体与TSS之间的距离，命名为T40N（T代表TSS，N代表核小体，数字代表距离），T50N，和T70N。利用体外重构方法，成功组装了分别结合三种+1核小体的PIC-Mediator转录起始超级复合物（84个蛋白，分子量4.3MD），通过结构和生化分析，发现+1核小体与PIC-Mediator复合物存在多处直接相互作用及多种作用方式，通过结合 TFIIH和Mediator多个亚基，促进PIC-Mediator在染色质上的组装和转录起始活性。

+1核小体与PIC-Mediator的结合还表现出与功能密切关联的如下特点：

核小体位置的偏好性（图2）。PIC-Mediator更倾向于结合T40N核小体，形成较为稳定的相互作用。也可以结合T50N核小体，这时候会有一部分核小体趋向于解离，原因是核小体与复合物距离增加，结合要造成DNA的弯折产生张力部分抵消结合的吸引力。而到了T70N核小体，直接接触就没有了。体外转录起始活性实验显示，T40N核小体可以增强转录活性，而T70N则没有。这些结果不仅很好地解释了体内测序的结果（+1核小体与TSS距离40bp左右），也提示了其产生背后的原因。也就是说，PIC-Mediator复合物要整合启动子上的序列信息与核小体的位置信息，决定其结合位点和转录起始位点。人体中大部分启动子不含有TATA box这样的强定位序列，PIC-Mediator是以+1核小体为主要的参考点，产生适宜的结合方式，这种结合的位置决定了转录起始位点。

PIC-Mediator与三种不同定位核小体的结构。A. T40N, T50N和T70N三种启动子模板的模式图。B，C，D. 结合T40N，T50N，T70N的PIC-Mediator复合物结构。E. T50N核小体（黄色）的四种不同结合状态。

相互作用的包容性。核小体与PIC-Mediator通过静电相互作用结合，没有明显的序列特异性。比如TFIIH和Mediator亚基的碱性区，在整体复合物的框架下，结合核小体DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性表面。这种结合的特点是特异性低，只要电荷相反，位置临近，就有吸引力。因此包容度高，可以允许一定程度的构象变化及核小体的位置变化，使得转录机器能够结合到各种不同启动子的核小体上。

目前主流观念认为，转录机器在进入到延伸阶段才会碰到核小体，该项工作首次在分子水平上展示出了转录起始复合物与+1核小体的紧密结合，将转录起始位点附近的表观遗传信号和转录起始建立了直接关联。从转录起始位点到+1核小体之间的几十个核苷酸范围内（约14纳米），发生的一系列转录起始事件（RNA合成，聚合酶前移，暂停，释放，加帽，延伸等），数十种不同转录调控复合物（上百种蛋白）的动态解离和结合，都需要考虑+1核小体及其表观遗传调控的影响（图3）。这一研究将改变我们对转录起始过程和以+1核小体为代表的染色质相互关系的传统看法，为研究表观遗传和基因表达调控提供新的指导框架和结构基础。

+1核小体在转录起始到转录早期延伸系列动态过程中都可能发挥作用。从TSS到+1核小体为40bp左右，约为14nm，在这个范围内会发生一系列转录早期事件，也是基因表达调控的核心区域。

复旦大学生命科学学院青年研究员陈曦子、复旦大学生物医学研究院2020级博士生王鑫鑫、2019级直博生刘维达为本文共同第一作者，徐彦辉为通讯作者。

专家点评

李国红 研究员（中科院生物物理所）

在真核生物中，基因转录的精准调控在许多重要生物学过程中发挥至关重要的作用。基因转录包括转录起始、转录延伸和转录终止三个过程，其中转录起始是基因转录调控的核心，转录起始过程发生在基因启动子区。我们知道，真核生物中，基因组DNA缠绕组蛋白八聚体形成核小体，在连接组蛋白H1和其他染色质架构蛋白的作用下形成各种染色质高级结构。因此，启动子区域的染色质结构在基因转录起始过程中发挥重要的调控作用。前期各种生物化学和基因组学实验发现基因启动子区域的核小体定位和染色质结构具有非常鲜明的特征，比如启动子区域核小体被剔除或移位，形成一个开放的染色质区域，这样转录机器可以招募到启动子区域，并组装形成转录起始复合物。另外，非常有趣的是，在大多数基因的启动子区域，转录起始位点下游的第一个核小体（称为+1核小体）定位非常有规律，一般位于基因转录起始位点（TSS）下游约40 bp处。并且，表观遗传组学研究发现，在高表达基因的+1核小体上富含各种重要的组蛋白化学修饰（比如H3K4me3和组蛋白乙酰化）和特异的组蛋白变体（H2A.Z和H3.3）。现在领域内对于+1核小体及其表观遗传特征在转录起始调控中的功能仍然不是很清楚，比如转录起始复合物与+1核小体的相互作用及其表观遗传调控机制等。近年来，随着冷冻电镜技术的发展，徐彦辉和Patrick Cramer等团队在转录起始复合物（PIC）和PIC-Mediator转录起始超级复合物的招募与组装方面取得了一系列重要的突破性进展和成果。但是，上述所有转录起始复合物结构都是基于裸露DNA模板，无法展示+1核小体与转录起始复合物之间的结构功能关联性。

徐彦辉团队今天在Science上发表的这项工作，正是回答了上述关键问题。该项研究解析了包含+1核小体的PIC-Mediator复合物结构，首次展示了转录起始复合物与+1核小体的紧密结合，表明+1核小体对转录起始复合物在染色质上组装的重要调控作用，建立了表观遗传和转录起始的直接关联。该项工作实验体系复杂，难度非常大，实验设计非常巧妙，研究思路非常新颖。

1）研究团队为了证明+1核小体定位的重要功能，通过改变+1核小体与TSS之间的距离（40 bp, 50 bp 和70 bp），设计和构建了三个不同DNA模板，这个实验设计很巧妙，可以回答为什么一般+1核小体定位在TSS下游40 bp处。该研究结果显示，+1核小体与PIC-Mediator的结合具有两个显著的特征：核小体位置的偏好性（～40 bp）和相互作用的包容性，很好解释了PIC-Mediator复合物怎样通过整合启动子上的序列信息与核小体的位置信息，决定其结合位点和转录起始位点，精准调控各种不同基因的转录起始。

2）利用体外重构方法，研究团队成功组装了分别结合三种+1核小体的PIC-Mediator转录起始超级复合物（84个蛋白，分子量4.3MD），并解析了它们的冷冻电镜结构。这个体系非常复杂，涉及蛋白质种类多（包含近百个蛋白质），结构形式高度动态，难度非常大。我本人在Danny Reinberg实验室做博士后期间做过类似的工作，我们利用体外转录体系，研究RNA Pol II在30-nm染色质纤维上的转录过程，深知这个体外重构体系的难度和不容易。几年前，在施扬老师、石雨江老师和蓝斐老师组织的表观遗传学retreat中，徐彦辉老师与本人有过深入交流，当时我对利用冷冻电镜解析转录起始复合物和转录延伸过程的调控机制还持怀疑态度。最近，徐彦辉团队和德国马普所Patrick Cramer以及日本东京大学Hitoshi Kurumizaka等团队在转录起始复合物招募与组装以及RNA Pol II在核小体上转录延伸调控机制上取得了一系列突破性进展。本人对徐彦辉老师团队取得的进展和成果表示祝贺，也对完成这些工作的学生和工作人员表示敬佩，同时对我们自己研究工作也是一种极大的鼓励。

3）在该项研究中，徐彦辉研究团队在+1核小体构建了组蛋白变体H2A.Z核小体。在大多数高表达或可诱导基因的启动子下游+1核小体富含组蛋白变体H2A.Z，但是现在大家对H2A.Z核小体的生物学功能还有不少争议。徐彦辉团队的该项工作显示，TFIIH和Mediator亚基的碱性区可以与核小体DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性区域结合，H2A.Z核小体的酸性区域比常规核小体的酸性区域更酸，所以PIC-Mediator复合物与H2A.Z核小体的作用更强，这也许对调节转录起始复合物与+1核小体的功能互作具有重要意义。最近Patrick Cramer和Hitoshi Kurumizaka两个团队利用冷冻电镜，解析了RNA Pol II转录延伸复合体（包含转录延伸因子DSIF（Spt4/5）、Spt6、PAF1、FACT (Spt16/SSRP1)和TFIIS）在核小体上进行转录延伸机制，捕获到延伸复合体在核小体DNA上前进的细节，发现延伸复合体可介导下游核小体解聚并在上游重新组装，其中组蛋白伴侣FACT或Spt6促进该过程，从而维持转录过程中核小体的完整性，这也验证我们研究团队几年前FACT-核小体单分子磁镊操纵的研究结果。值得一提的是，上述两个团队都是用常规H2A核小体来研究转录延伸机制，但是在大多数基因的+1核小体是H2A.Z核小体，未来利用冷冻电镜和单分子技术研究转录延伸复合物通过含有H2A.Z的+1核小体的结构细节和动力学过程将会更有生理学意义。

综上所述，徐彦辉团队的这项工作实验设计巧妙，实验体系复杂，难度大，内容丰富，研究思路新颖，结构非常漂亮。该项研究不仅改变了我们对转录起始过程和以+1核小体为代表的染色质相互关系的传统看法，还为未来研究转录起始过程中从转录起始位点到+1核小体之间发生的一系列转录起始事件（RNA合成，聚合酶前移，转录停滞与释放，RNA加帽和转录延伸等）的表观遗传调控机制提供了研究体系和指导框架。在此，再次祝贺徐彦辉团队在转录起始调控机制研究方向上取得又一重要进展，期待他们团队在后续研究中取得更多的突破。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abn8131