【学术前沿】陆发隆/刘玉胜/吴克良/周兵/王加强揭示通过poly(A)尾巴重塑母源mRNA调控人类…

点评 | 高绍荣（同济大学）、颉伟/邹卓宁（清华大学）

卵子向胚胎转变过程是人类繁衍后代的最重要的生命过程之一。在该过程中，人类胚胎8-细胞时期合子基因组激活之前，卵子和胚胎中DNA是不转录的。因此，卵子向胚胎转变过程主要受卵子中储存的母源mRNA调控。之前小鼠中的研究表明，poly(A)尾巴的长度可调控母源mRNA的翻译，从而使人们推测poly(A)尾巴介导的转录后调控在哺乳动物卵子向胚胎转变中发挥着至关重要的功能。然而，目前人们对人类卵子和胚胎中mRNA的poly(A)尾巴的状态一无所知。

2023年1月16日，中国科学院遗传与发育生物学研究所陆发隆（中国细胞生物学学会染色质生物学分会委员）研究团队与东北林业大学刘玉胜研究团队、山东大学生殖医学研究中心陈子江/赵涵/吴克良研究团队、中国科学院动物研究所周兵研究团队以及东北农业大学王加强研究团队通过紧密合作，在Nature Structural & Molecular Biology发表题为Remodeling of maternal mRNA through poly(A) tail orchestrates human oocyte-to-embryo transition的研究论文，通过团队开发的PAIso-seq和PAIso-seq2技术绘制了人类卵子向胚胎转变过程中的两套相互支撑的全转录组poly(A)尾巴图谱，发现在人类卵子向胚胎转变过程中mRNA的poly(A)尾巴发生了全局性的重塑——包括卵子成熟过程中母源mRNA全局性poly(A)去腺苷酸化与3′-UTR部分降解、大量的非A碱基掺入、以及受精后全局性mRNA重新加尾；同时，该团队对全局性母源mRNA重塑的机制进行了初步探索，并证明poly(A)尾巴介导的母源mRNA重塑是人类受精卵第一次卵裂所必需的。这一重要工作为将来研究人类卵子成熟和早期胚胎发育过程中的母源RNA转录后调控奠定了坚实的基础，为不孕不育相关疾病的机制研究打开了一扇新的大门。

人类卵子和早期胚胎样本非常珍稀，此前的poly(A)尾巴分析方法均需要大量的起始样本量，无法应用于人类卵子和早期胚胎。因此，研究团队开发了高灵敏度、高准确度的包含完整poly(A)尾巴序列的全长转录组测序技术——PAIso-seq（详见BioArt报道：Nat Comm | 陆发隆组发开PAIso-seq方法揭示RNA poly(A)尾巴内部广泛存在其他碱基修饰）【1,2】。该技术可以实现单个卵子/早期胚胎全转录组全长转录本变体及其完整poly(A)尾巴的序列测定。研究团队通过该技术分析了9个时期的人类卵子和早期胚胎的包含完整poly(A)尾巴序列的全长转录组，发现在卵子向胚胎转变过程中人类母源mRNA的poly(A)尾巴上发生了剧烈地重塑，其中在1-细胞、2-细胞和4-细胞期胚胎中发现了两个完全超出传统认知的特征：约60%的mRNA以有poly(A)尾巴的降解中间体形式存在，以及在约60%的mRNA poly(A)尾巴内部存在非A碱基尤其是U碱基的掺入。

通过对潜在的poly(A)尾巴调控因子进行敲降，并在1-细胞期进行PAIso-seq分析，研究团队揭示了人类卵子向胚胎转变过程中母源mRNA poly(A)尾巴介导的全局性重塑的机制：在卵子成熟的过程中通过BTG4依赖的去腺苷酸化进行全局性的去尾，甚至对3′-UTR进行了部分降解；在去尾或者3′-UTR部分降解的mRNA的3′端发生TUT4/7依赖的U碱基掺入；受精之后再发生全局性的mRNA重新加尾，这些重新加尾可以发生在U碱基修饰之后，也可以发生在没有U碱基修饰的3′端；全局性重新加尾的过程中伴随着TENT4A/B依赖的G碱基的掺入，从而稳定新生成的poly(A)尾巴 (图1)。

图1：人类卵子向胚胎转变过程中母源mRNA poly(A)尾巴重塑

因为PAIso-seq从原理上需要RNA的3′端有十几个A碱基才能将其有效捕获，所以PAIso-seq数据中没有直接的证据支持上述母源mRNA重塑模型中全局性去腺苷酸化生成的没有poly(A)尾巴、很短的poly(A)尾巴或者末端加上U碱基修饰的转录本。为了获取这些直接的证据，研究团队另外开发了PAIso-seq2技术【3】，该技术可以无偏差地捕获这些转录本 (图2)，代价是技术的灵敏度低于PAIso-seq。

图2：PAIso-seq和PAIso-seq2差别示意图

5个时期的人类卵子和胚胎的PAIso-seq2数据很好地验证了上述母源mRNA重塑模型——在MII期卵中检测到了PAIso-seq数据推测存在的大量没有poly(A)尾巴、很短poly(A)尾巴或者末端加上U碱基修饰的mRNA转录本。PAIso-seq数据和PAIso-seq2数据相互补充，很好地支撑了poly(A)尾巴介导的母源mRNA重塑的发现。

为了验证母源mRNA重塑的功能，研究团队通过虫草素 (3′-dA) 这一poly(A)尾巴加尾抑制剂来处理受精卵，来抑制母源mRNA重塑中最后一步的全局性mRNA重新加尾，结果表明虫草素处理的人类受精卵无法完成第一次卵裂，证实母源mRNA重塑是人类卵子向胚胎转变过程所必需的。

东北林业大学刘玉胜教授、山东大学赵涵教授、中科院动物所与中科大联合培养博士研究生邵方红以及东北农业大学博士研究生张轶伟为本文共同第一作者，中科院遗传发育所陆发隆研究员、山东大学吴克良教授、中科院动物所周兵研究员与东北农业大学王加强教授为本文的共同通讯作者。

专家点评

高绍荣（同济大学）

哺乳动物卵子向胚胎转变过程包括卵子成熟、精卵结合生成受精卵以及着床前胚胎发育，是发育生物学和生殖生物学的核心问题。近年来，随着微量样本表观基因组学的进步，领域内多个团队包括我们团队一起成功解析了着床前胚胎发育过程中包括组蛋白修饰、染色质开放性、DNA甲基化和基因组三维结构等多维表观基因组的重编程。然而卵子向胚胎转变过程在合子基因组激活之前染色质DNA是不转录的，不受表观基因组影响；该过程受卵子生长过程中储存的母源RNA的转录后调控控制。

近日，中科院遗传发育所陆发隆团队与山东大学陈子江团队等多个团队合作，揭示了在人类卵子向胚胎转变过程中mRNA poly(A)尾巴介导的全局性的母源mRNA重塑。一方面，该工作揭示了poly(A)尾巴长度在发育过程中的动态变化，这些poly(A)尾巴长度的变化可能调控了全转录组的mRNA翻译水平随着发育过程的变化。另一方面，更重要的是该工作揭示了在人类卵子向胚胎转变过程中母源mRNA发生了以生成大量带有poly(A)尾巴的降解中间体和U与G为主的大量非A碱基掺入poly(A)尾巴的全局性的poly(A)尾巴介导的重塑。进一步，团队对母源mRNA重塑的生化机制进行了探索，并证明该poly(A)尾巴介导的母源mRNA重塑是人类受精卵启动第一次细胞分裂所必需的。

该项突破的取得依赖于陆发隆和刘玉胜在包含完整poly(A)序列的转录组测序技术上的突破，他们开发的单个卵子灵敏度的PAIso-seq和全面检测RNA 3'端的PAIso-seq2技术结合在一起揭开了人类卵子和早期胚胎中的poly(A)尾巴状态的神秘面纱。这两项技术不仅仅可以用于卵子和早期胚胎，可以预期在各种生命活动过程的转录后调控机制解析中也将发挥重要作用。

该研究是人类卵子向胚胎转变研究的重要突破，为进一步深入理解该过程的转录后调控指明了方向，并且提供了重要数据资源。同时，该研究的发现提示了多个值得未来深入研究的问题：为什么卵子成熟的过程中发生mRNA的3'-UTR部分降解并且这些降解中间体可以稳定存在？在受精卵中约2/3的母源mRNA的poly(A)尾巴中掺入了U碱基，这些U碱基编码了什么样的信息，对mRNA以及对发育有何调控功能？什么样的因子调控了受精后全局性mRNA重新加尾？poly(A)尾巴与其他mRNA转录后调控机制如何协同调控卵子向胚胎转变过程？回答这些问题将帮助我们更深入地理解人类卵子向胚胎转变过程，为女性不孕不育相关疾病的诊断和治疗提供重要理论基础。

专家点评

颉伟/邹卓宁（清华大学）

mRNA多聚腺苷酸尾（polyA tail）对于翻译和RNA稳定性具有重要意义。在果蝇、斑马鱼和小鼠卵子及早期胚胎发育过程中，polyA尾长度与翻译效率成正相关，而在体细胞中polyA尾长度通常与RNA稳定性相关。在卵母细胞成熟到合子基因组激活之前，由于基因组基本不进行活跃的转录活动，基因调控经常由转录后调控驱动。在小鼠卵子发育过程中，如果polyA尾不能被正常缩短会影响母源RNA的降解；在早期胚胎中，如果polyA尾不能正常延伸则会影响到合子基因组的正常激活。但是在人类卵子和早期胚胎中的polyA尾是如何调控的仍然知之甚少。

陆发隆研究员课题组之前借助三代测序手段，开发了微量细胞polyA尾检测技术PAIso-seq以及PAIso-seq2。在这项研究中，作者利用这两种方法首次描绘了人类卵子及早期胚胎的包含polyA尾序列的全长转录组图谱，并观察到在此期间polyA尾经历了剧烈的去腺苷酸化及加腺苷酸化过程。有趣的是作者发现在去腺苷酸化过程中，一些基因的3’UTR序列可能经历由BTG4介导的部分降解，产生一个中间过渡产物，之后会再次加上polyA尾，在这个过程中，polyA尾中会由TUT4/7, TENT4A/B部分协助掺入非A碱基，如U碱基等。作者通过基因敲低实验探究了这些RNA调控因子对于polyA尾的动态变化和RNA稳定性的影响。

这项研究大大拓展了我们对人类早期胚胎中RNA调控的认知，同时也提出了更多的科学问题。比如，部分基因的3’UTR序列经历部分降解而非完全降解，是否还有其他机制如RNA结合蛋白等在保护它们在卵子及早期胚胎中的RNA稳定性？这些中间产物是否有其他的功能？人类卵子及早期胚胎中polyA尾动态变化是如何与翻译调控关联的？可以预见PAIso-seq和其他相关微量细胞polyA尾检测技术将会极大促进卵子和早期胚胎发育过程中的转录后调控研究。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41594-022-00908-2

参考文献

1. Liu, Y., et al., Poly(A) inclusive RNA isoform sequencing (PAIso-seq) reveals wide-spread non-adenosine residues within RNA poly(A) tails. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 5292.

2. Liu, Y., et al., Transcriptome-wide measurement of poly(A) tail length and composition at subnanogram total RNA sensitivity by PAIso-seq. Nat Protoc, 2022. 17(9): p. 1980-2007.

3. Liu, Y., et al., Comprehensive analysis of mRNA poly(A) tails by PAIso-seq2. Sci China Life Sci, 2022.

原标题：《【学术前沿】陆发隆/刘玉胜/吴克良/周兵/王加强揭示通过poly(A)尾巴重塑母源mRNA调控人类卵子向胚胎转变》

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