追问｜《细胞》非人灵长类胚胎研究背后：14天伦理准则已过时？

·“早期器官的形成和发育是发育生物学中一个比较重要的阶段，但这是一个‘黑匣子’，大家对它都不了解，两个研究团队通过体外培养来模拟胚胎在体内的发育，但和体内（胚胎发育）是否完全一样，有待进一步研究。”

当地时间5月11日，《细胞》（Cell）杂志刊登了两篇背靠背论文，两个研究团队通过各自的创新性平台将非人灵长类胚胎的体外培养延长至25天，重现并系统研究了灵长类胚胎早期发育阶段的多个重要事件。

据悉，早期胚胎发育异常与出生缺陷直接相关，研究早期胚胎发育过程、探究发育机理，有助于揭示病理性胚胎发生机制，提升相关疾病诊疗效率。有数据显示，目前已知的出生缺陷病种超过8000种，中国出生缺陷发生率约为5.6%，每30秒钟就会有一名缺陷儿出生。

“这两项工作最主要的贡献是把灵长类胚胎体外培养的时间延长至25天。这两个团队之前也发表过论文，将灵长类胚胎的体外培养时间延长到20天，这次又延长了5天，这样就可以看到原肠运动和早期器官分化等胚胎早期发育阶段的重要事件。” 5月13日，同济大学生命科学与技术学院院长、长期从事胚胎发育与体细胞重编程的表观调控机制以及干细胞转化医学研究的高绍荣教授向澎湃科技表示。

“早期器官的形成和发育是发育生物学中一个比较重要的阶段，但这是一个‘黑匣子’，大家对它都不了解，两个研究团队通过体外培养来模拟胚胎在体内的发育，但和体内（胚胎发育）是否完全一样，有待进一步研究。”高绍荣说。

据悉，人早期胚胎发育起始于受精卵（胚胎期第0天）。受精卵经过数次卵裂形成囊胚，囊胚于胚胎期第7天左右种植入母体子宫并进一步发育，于胚胎期第14天启动原肠运动。原肠运动是早期胚胎发育过程中的里程碑事件，在此过程中，胚胎细胞发生大规模分化、迁移和重排，并形成外、中、内三胚层和体轴。

外胚层于胚胎期第20天左右进一步发育形成位于中间的神经板（也称为神经外胚层，neural plate or neural ectoderm）、位于两侧的表皮外胚层（surface ectoderm）和位于两者之间的神经板边缘（neural plate border）。神经板弯曲、折叠、增厚并进一步闭合，形成神经管（neural tube）。闭合的神经管沿胚胎背腹轴分化出不同的神经祖细胞。神经管形成的过程称为神经胚形成（neurulation）。中、内胚层则进一步发育出体节、心脏、肠管等早期器官的原基，胚胎自此进入更加复杂的器官发育阶段。

由于人早期胚胎样品极难获取，以上事件在人类胚胎中无法被直接探究和揭示。过去，研究人员已通过体外胚胎培养技术初步揭示了人胚胎期第14天之前的发育事件，但14天后的发育事件则无从知晓，因为人类胚胎体外研究须遵循必须在胚胎期14天前终止的伦理规则。因此，研究人员转而使用与人类进化和发育生物学特征高度相似的灵长类胚胎来替代人类胚胎，搭建非人灵长类胚胎体外培养体系，以理解早期胚胎发育调控机制。

猴胚体外培养延长至25天

第一篇论文由省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室、昆明理工大学灵长类转化医学研究院谭韬、陈永昌、季维智团队，以及中国人民解放军总医院、血液与健康全国重点实验室刘兵团队及德州西南医学中心（University of Texas, Southwestern Medical Center at Dallas, UTSW）吴军团队合作完成，题为《从囊胚到早期器官形成的子宫外猴胚培养》（Ex utero monkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis）。该团队开发了一种3D培养系统——优化猴子宫外培养（Enhanced Monkey Ex Utero Culture , EMEUC），实现了食蟹猴胚胎体外25天的长时程培养。利用该平台，研究人员系统研究了原肠运动及造血等早期组织器官发生的谱系特化轨迹和分子演进规律。

谭韬等人论文截图。

在这项研究中，谭韬等人的团队首先优化了前期食蟹猴胚胎培养系统，借助细胞外基质构建了3D培养环境，同时借助葡萄糖的加入，促进了胚胎体外发育，培养胚胎在形态、发育进程等与体内胚胎高度一致，大约对应体内的卡内基阶段（carnegie stage）8c。

借助这一优化的3D培养体系，谭韬等人观察到早期胚胎发育过程的多个关键事件。他们发现EMEUC培养的胚胎除了早期神经分化，还出现了造血谱系特化，体外胚胎的造血谱系特化高度模拟了体内卵黄囊的两个波次造血发生，研究团队捕获并识别了猴第一波次造血的关键前体细胞（包括生血成血管细胞、第一波次造血祖细胞），这也是迄今为止研究人员首次在非人灵长类胚胎中精确识别和系统解析到它们。此外，与以往的人多能干细胞的体外分化体系相比，体外培养的猴胚能够产生更接近人体内第二波次造血的生血内皮细胞，表明该体系有望成为更合适的灵长类早期造血的研究模型。

除了外胚层和中胚层的谱系特化外，谭韬等人团队还观察到内胚层的特化，在体外培养猴胚胎中发现了早期肠（primitive gut）的形成, 其与体内猴胚胎及人胚胎肠亚群高度一致。进一步的研究揭示了分别与前肠和后肠形成相关的信号通路，并提出内脏内胚层细胞参与了前、后肠发育过程。

第二篇论文来自中国科学院动物研究所的王红梅研究员、郭帆研究员、李伟研究员和美国宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania) 尼古拉斯·普拉切塔（Nicolas Plachta）教授，题为《3D培养体系获得食蟹猴早期神经胚胎形成的过程》（Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture）。研究者建立了一个可支持食蟹猴胚胎体外发育至受精后25天的3D长时程培养体系，并基于该体系探究了灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经发育过程中的核心事件和谱系特征。

王红梅等人论文截图。

在这项研究中，王红梅等人的团队首先比较了人类和非人灵长类胚胎2D和3D体外培养体系中胚胎的大小和存活率，发现2D和3D培养体系都能支持胚胎发育至胚胎期第20天。在2D体系下，胚胎由于胚外组织发育旺盛而迅速增大，但内部的胚体发育并不好。而在3D体系下，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体结构显著发育。为了保证胚体的发育，研究者继续优化3D体系，优化后的体系能支持33.7%的食蟹猴胚胎发育到胚胎期第25天，该体系被命名为3D长时程培养体系（prolonged in vitro culture，pIVC）。

借助pIVC系统，王红梅等人团队确认体外胚胎重现了早期神经胚胎形成的多个关键过程，包括神经嵴形成与特化、神经管闭合、神经前体细胞的区域化、神经前体细胞分化形成神经元的过程等。

pIVC胚胎神经管细胞的特化。 中科院动物所 供图

此外，王红梅等人还通过单细胞多组学测序技术，对9个pIVC胚胎的3850个单细胞的转录组和1862个单细胞的DNA甲基化和染色质可及性进行测序和分析，结果证实了体外培养的胚胎形成了内、中、外三个胚层，包括原始生殖细胞，并且建立了晚期原肠运动阶段的DNA甲基化和染色质可及性特征。

据《自然》报道，英国剑桥大学（the University of Cambridge）发育生物学家娜奥米·莫里斯（Naomi Moris）表示，这些研究在开发能比以前更长时间地维持子宫外胚胎的方法方面迈出了重要的一步。但她也提出了警示，“在实验室培养的胚胎看起来和行为像真实的东西之前，还有很长的路要走。它们（体外培养的胚胎）看起来仍然与我们期望的略有不同。肯定还有改进的余地。”

“14天伦理准则”是否可以改变？

人类胚胎发育研究一直遵循“14天伦理准则” ，即在人类胚胎体外研究工作中，自受精之日起，人类胚胎体外培养的时间不得超过14天。

1978年，全球首例试管婴儿的诞生引起了社会各界对胚胎体外培养的巨大关注。次年，美国道德咨询委员会（Ethics Advisory Board）向美国卫生教育与福利部（U.S. Department of Health, Education, and Welfare，HEW）提交了一份报告，首次明确了人胚胎体外培养的14天界限。随后，英国政府召集了16位专家（包括医生、科研人员等）组成“沃诺克委员会”（Warnock Committee），该委员会于1984年提出政策和立法建议：“由体外受精产生的人类胚胎，无论是冷冻状态下或非冷冻状态下，如果没有进行胚胎移植，不能在体外存活至超过受精后第14天。”同时建议将超出期限的人类胚胎研究都定义为刑事犯罪。2004年，中国科技部和原卫生部联合颁布的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》中，也明确了14天准则的限制。

很长一段时间，科学家们只能实现人类胚胎在受精后6-7天的体外培养，但随着研究的不断进步，时间的限制已经在被不断地突破。

2016年，美国科学家阿里·布里凡（Ali Brivanlou）和英国科学家玛格达莱娜（Magdalena Zernicka-Goetz）分别在《自然》(Nature)和《自然细胞生物学》（Nature Cell Biology）发表研究成果，实现了人胚胎受精后13天的培养，逼近14天的期限。

为规避进一步研究的伦理限制，谭韬等人团队、王红梅等人团队研究灵长类胚胎的体外培养体系，并同时于2019年11月在《科学》（Science）杂志发文，表明实现了食蟹猴胚胎体外20天的培养。

2022年，谭韬、季维智在《科学与社会》期刊发文提问：“这些研究表明，人类胚胎体外培养超过14天，完全理解人类原肠运动机制是有可能的。在前沿科学研究和人类健康的需求推动下，‘14天伦理准则’是不是必须继续严格遵守、保持不变？”

高绍荣向澎湃科技表示，“全世界很多科学家都在讨论‘14天伦理准则’是否需要改变这件事，但改变并不容易。目前‘14天伦理准则’是否进行修改由各国各自把握，中国还没有修改，各个国家也还没有制定相关的规制，还需要更多讨论。”

2021年，国际干细胞研究学会发布的干细胞研究及其向医学转化应用的最新指南建议：“考虑到人胚胎培养取得的进展，以及这类研究具有创造促进人类生命健康和福祉的有益知识的潜力，14天后胚胎的研究如果在某个国家（或地区）获得广泛的公众支持，并且地方政策和法规允许的话，可以开展相关研究。”

谭韬和季维智认为，相关的伦理规制存在一定的滞后。“这种伦理规制的滞后将会影响我国在此方面的创新发展和生命科学的前沿领域取得新的突破，为解决不孕不育和发育疾病服务。是时候重新评估14天的限制，对14天后人胚胎研究制定新的伦理规制。”