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两篇Cell重磅背靠背研究，实现了食蟹猴胚胎体外25天的长时程培养

2023-05-20 07:28

来源：澎湃新闻·澎湃号·湃客

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原创 Cell Press CellPress细胞科学

生命科学Life science

出生缺陷严重影响国民健康。有数据显示，当前已知的出生缺陷病种超过8000种，我国出生缺陷发生率约为5.6%，每30秒钟就会有一名缺陷儿出生。出生缺陷的发生与早期胚胎发育异常直接相关。解析早期胚胎发育事件及其调控机制有助于我们深入理解早期胚胎和器官发育与疾病发生的关系，为怀孕早期流产和出生缺陷防治及发育源性疾病的诊治提供理论基础和新的途径，这也是当前生殖医学领域亟待解决的难点与热点之一。但我们对这一时期人胚胎发育，特别是早期着床后胚胎发育知之甚少，处于“黑匣子”状态，对早期胚胎发育调控机制的深入理解，亟待创新性研究体系的建立与理论和技术突破。

2023年5月11日，两篇背靠背研究在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell发表，实现了食蟹猴胚胎体外25天的长时程培养。搭建非人灵长类胚胎体外培养体系，揭示非人灵长类胚胎发育特征，将极大提升我们对包括人类在内的灵长类早期胚胎发育及相关疾病的认识。

省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院谭韬/陈永昌/季维智团队、中国人民解放军总医院/血液与健康全国重点实验室刘兵团队及德州西南医学中心吴军团队在Cell期刊发表题为“Ex utero monkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis”的研究论文，研究开发了一种3D培养系统（EMEUC），实现了食蟹猴胚胎体外25天（25 d.p.f.）的长时程培养（图一）。利用该平台，研究人员系统研究了原肠运动及造血等早期组织器官发生的谱系特化轨迹和分子演进规律。

图一体外培养食蟹猴胚胎双光子三维重构（上图）及示意图（下图）。

研究者首先优化了前期食蟹猴胚胎培养系统，借助细胞外基质构建了3D培养环境，同时借助葡萄糖的加入，促进了胚胎体外发育，培养胚胎在形态、发育进程等与体内胚胎高度一致，大约对应体内的卡内基阶段（carnegie stage， CS）8c。结合单细胞转录组（scRNA-seq）和免疫荧光染色验证，研究人员发现EMEUC培养的胚胎除了早期神经分化，还出现了造血谱系特化，其高度模拟了体内卵黄囊的两个波次造血发生，尤其是捕获并识别了猴第一波次造血的关键前体细胞（包括生血成血管细胞（Hemogenic angioblast）、第一波次造血祖细胞），这也是迄今为止它们在非人灵长类胚胎中被首次精确识别和系统解析，而在以往的人多能干细胞体外分化体系中并不能很好的重现。此外，与人多能干细胞的体外分化体系相比，体外培养的猴胚能够产生更接近人体内第二波次造血的生血内皮细胞，这些结果表明该体系有望成为更合适的灵长类早期造血的研究模型。接下来，研究团队通过人、猴、鼠跨物种的整合分析发现，猴的第二波次造血与人更为接近，表明人、猴在早期造血发育具有较强的保守性而与啮齿类存在差异。最后，该研究还进一步聚焦猴第一波次造血特化的过程，并系统揭示了猴和小鼠在该过程中的物种保守和差异的分子事件（图二）。

图二体外培养食蟹猴胚胎早期造血发生。A.主要的卵黄囊内皮及两个波次造血细胞群体；B.不同的细胞群体的时间动力学变化；C.人、猴、鼠胚胎早期主要内皮造血相关群体的相关性分析。

除了外胚层和中胚层的谱系特化外，研究人员还观察到内胚层的特化，在体外培养猴胚胎中发现了早期肠（primitive gut）的形成，并与体内猴胚胎及人胚胎肠亚群高度一致；进一步研究表明，BMP和EGF信号通路与前肠形成有关，而WNT和Hedgehog信号通路可能在后肠发育中发挥重要作用，并提出内脏内胚层细胞参与了前、后肠发育过程。前期研究表明，体外培养猴胚胎可以形成原始生殖细胞样细胞（PGCLC），PGCLC细胞是否可以在体外发生迁移并进一步成熟，尚不了解。研究者们借助EMEUC系统，揭示随着培养的进行，PGCLC细胞开始向卵黄囊迁移，随之代谢模式从糖酵解向氧化磷酸化转变。最后，作者系统揭示了食蟹猴早期胚胎发育中的X染色体剂量补偿调控过程，值得指出的是雌性PGCLC中X染色体总体基因表达水平逐渐上调，且存在X染色体再激活过程。参与X染色体失活的长链非编码RNA（lncRNA）XIST在雄性早期PGCLCs中很少或没有表达，晚期升高，而在雌性PGCLC中表达水平相对稳定。

综上，研究者们开发了一种能够支持食蟹猴胚胎体外发育至早期器官发生的3D培养体系，并系统研究了非人灵长类从原肠胚形成到早期器官发生过程的重要细胞组成及谱系分化轨迹，研究结果将有助于了解人类胚胎发育畸形及怀孕早期流产的病因。

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作者介绍

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谭韬

教授

谭韬，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授，博士生导师。主要从事灵长类生殖与发育生物学研究。相关工作发表在Science，Cell，Cell Research，Nature Communications, Protein Cell, Cell Discovery，Biology of Reproduction等学术期刊。曾获中国青年科技奖，中国细胞生物学学会干细胞生物学分会干细胞研究创新科学家及青年研究员奖，中国细胞生物学学会青年科学家奖。获国家自然科学基金、科技部重点研发计划等项目支持。现担任中国生物工程学会青年工作委员会委员、中国动物学会生殖生物学分会委员。

陈永昌

教授

陈永昌，昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授、生命科学与技术学院院长，国家杰出青年科学基金项目获得者。长期从事遗传性神经发育疾病机制与治疗研究，利用基因编辑创建了基因型与表型高度模拟临床患者的Rett综合征、杜氏肌营养不良症等疾病的非人灵长类模型，并在相关疾病机制及治疗研究方面取得突破。在Cell，Cell Stem Cell等杂志发表论文30余篇；成果曾入选中国生命科学十大进展。

季维智

中国科学院院士

季维智，中国科学院院士，欧洲科学院院士，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室主任，昆明理工大学灵长类转化医学研究院院长，中国细胞生物学会干细胞生物学分会会长、人类表型组研究协会（HPCC）委员。长期坚持灵长类生殖发育生物学的研究，围绕早期胚胎发育调控，干细胞多能性和人类疾病的猴模型及致病机理等科学问题，形成了从体外受精、胚胎早期发育、基因编辑以及干细胞等系统研究体系。率先在基因编辑灵长类动物模型取得重大突破，并获得了naïve猴多能性干细胞。实现了灵长类（人和猴）胚胎体外延长培养，解析了灵长类胚胎发育原肠发生与发育的重要事件，获得全球首例人猴嵌合体胚胎。在 Cell，Science，Nature，Cell Stem Cell，PNAS等杂志以通讯作者或第一作者发表 SCI 论文 100 余篇，其中，2014 年在 Cell 发表的基因编辑猴的论文被评价为人类疾病模型建立的里程碑性工作、入选 2014 年世界十大科技进展（MIT Technology Review）、2014 年 Cell 最佳论文(Cell)、 2014 年世界最成功的 8 大事件之一(Nature)。2021年发表的全球首例人猴嵌合胚胎被Nature、Cell杂志评选为“2021年最佳科学图片”。曾获“2015年中国细胞生物学会终身贡献奖”、“2019年何梁何利基金科学与技术进步奖生命科学奖”、“2021年中国细胞生物学学会干细胞生物学分会杰出贡献科学家奖”。2021年，发起成立“灵长类研究创新联盟”，联盟的成立对该领域人才培养、科学研究、成果转化、临床应用等产生重要的积极推动作用。

刘兵

研究员

刘兵，中国人民解放军总医院第五医学中心血液病医学部研究所所长、医学创新研究部核损伤救治实验室主任，血液与健康全国重点实验室副主任。从事造血发育与再生研究20余年，多项代表性成果在国际造血发育领域具有较高影响力，通讯作者（含共同）论文发表在Nature，Cell，Cell Stem Cell，Cell Research，Immunity，Nature Immunology等杂志，担任Cell Research和Blood Science杂志编委，承担国家重点研发计划项目、国家自然科学基金杰出青年和重点项目。获国家自然科学奖二等奖（第二完成人），成果入选《中国2020年度重要医学进展》和《国家十三五科技创新成就展》。培养的博士研究生荣获吴瑞奖（2016，2022年）。

吴军

助理教授

吴军，美国德克萨斯大学西南医学研究中心分子生物学系的助理教授，长期从事多能干细胞基础和转化研究。多能干细胞是可用于发育和疾病建模的强大工具，对于再生医学和生殖生物学具有广阔的应用前景。团队发现了具有独特分子和表型特征的多能干细胞，从而扩展了对多能态的认知。率先在异种嵌合以及基于干细胞的胚胎模型取得重大突破。获得全球首例人猪嵌合体和人猴嵌合体，首次报道发现细胞竞争是阻碍跨物种嵌合体形成的壁垒之一，构建世界首例人造人类囊胚和牛类囊胚结构。以第一作者或者通讯作者在Cell，Science，Nature，Cell Stem Cell，Nature Cell Biology 等杂志发表论文40余篇。研究的工作曾获2017年度科学十大突破（人猪嵌合体）和2021年度科学十大突破（人造人类囊胚）。获“NYSCF-robertson stem cell investigator award”, “University of Texas Southwestern Medical Center Grossman Investigator Award”, “University of Texas Southwestern Medical Center Endowed Scholar”, “Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Scholar”

白冰

讲师

白冰，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院讲师、硕士生导师。主要从事灵长类进化发育、生物信息学研究。相关工作发表在Cell，Nuclei Acid Research，National Science Review等学术期刊。获得中国博士后基金、省部级面上项目支持。

公彦栋

副研究员

公彦栋，中国人民解放军总医院第五医学中心血液病医学部研究所，副研究员，中国科协军事科技领域青年托举人才（2022年）、北京市科技新星（2021年）。2014年毕业于西安交通大学，获临床医学专业学士学位，2020年获军事科学院再生医学专业博士学位。主要聚焦利用单细胞组学结合生物信息学方法解析灵长类造血发育及血液相关疾病，相关研究成果以第一作者（含共同）发表在Cell，Nature，Immunity，Cell Research等杂志，以共同通讯作者发表在Cell Discovery杂志，主持包括国家重点研发计划、国家自然科学基金青年项目、北京市自然科学基金面上项目等国家、军队和省部级课题5项。研究成果入选《中国2020年度重要医学进展》、《中国血液学十大研究进展》（2020，2021年）。

孙念琴

博士后

孙念琴，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院博士后。主要从事非人灵长类植入后早期胚胎发育相关研究，研究成果发表于Science，Cell等学术期刊，曾获国家奖学金，2022年云南省优秀毕业生等奖励。

中国科学院动物研究所王红梅研究员、郭帆研究员、李伟研究员和美国宾夕法尼亚大学Nicolas Plachta教授于Cell在线发表了题为“Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture”的封面文章。该研究建立了一个可支持食蟹猴胚胎体外发育至受精后25天的3D长时程培养体系，并基于该体系探究了灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经发育过程中的核心事件和谱系特征。

2019年，王红梅团队及国内外同行将食蟹猴胚胎体外培养至d.p.f. 20，探究了灵长类早期原肠运动特征6,7。那么，灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经胚发育有哪些特征？是否可以延长食蟹猴胚胎体外发育历程，以进一步探究灵长类胚胎发育特征？这些问题一直是发育生物学领域前沿热点问题。

为了回答以上科学问题，研究者首先尝试构建可延长食蟹猴胚胎体外发育时程的培养体系。研究者比较了人类和非人灵长类胚胎2D（2D Ibidi µ-plates和2D coated with Matrigel, Ibidi-2D和M-2D）和3D（3D low-adhesion 96-well with Matrigel, M-3D）体外培养体系1,6,7，对不同体系中胚胎的大小和存活率进行评估。研究者发现，2D和3D体系都能支持胚胎发育到d.p.f. 20。在2D体系下，胚胎由于胚外组织发育旺盛而迅速增大，但内部的胚体发育并不好。而在3D体系下，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体结构显著发育。这些特征提示2D体系优先支持胚外组织生长，而胚外组织的过度生长可能限制了胚体本身的发育。为了保证胚体的发育，研究者继续优化3D体系。已报道的人类胚胎M-3D体系需要在d.p.f. 9-14的培养基中连续添加Matrigel，以模拟人类胚胎植入后环境1。鉴于食蟹猴胚胎植入子宫比人类胚胎浅表，因此，研究者仅在d.p.f. 10-12的培养基中加入Matrigel。优化后的体系能支持33.7%（n = 91）的食蟹猴胚胎发育到d.p.f. 25，该体系被命名为3D长时程培养体系（prolonged in vitro culture，pIVC；图1）。

图1. 能够支持食蟹猴胚胎体外发育至d.p.f. 25的3D长时程培养体系

为了探究灵长类早期神经胚发育过程，研究者首先对神经系统发育关键调控因子进行鉴定。首先，d.p.f. 20-22胚胎的胚体背侧中部可检测到OTX2+/OCT4+或OTX2+/SOX2+的细胞，提示OTX2的表达与外胚层细胞分化密切相关。PAX3和PAX6表达于d.p.f. 22-25的外胚层细胞，表明此时神经外胚层的特化。在d.p.f. 24-25的胚胎中可检测到神经外胚层闭合的区域，提示神经管形成。另外，OTX2、PAX8和NKX2.2阳性细胞分布于神经管的前部、中部和后部，提示此时的胚胎已有前脑、中脑和后脑/脊髓的区域化。结合神经管的形态特征，研究者发现胚胎前部神经管未闭合，后部神经管已闭合。未闭合和已闭合的神经管都表达N-CAD，而不表达E-CAD，表明胚胎在神经管闭合之前已完成E-CAD向N-CAD的转变。这些pIVC胚胎的神经管形态和分子表达特征与体内相同发育阶段的胚胎相似（图2）。伴随神经外胚层的发育，表皮和神经板边缘的发育同步进行。荧光染色结果显示，d.p.f. 22-25的胚胎已分化出TFAP2A+/E-CAD+的表皮细胞。在未闭合的神经板两侧和闭合的神经管两侧存在PAX3+/SOX9+/SLUG+细胞，标志着神经板边缘和其分化的神经嵴细胞的发育。

图 2. pIVC胚胎神经外胚层和神经嵴的特化

为了探究闭合的神经管细胞是否具有沿背腹轴不对称分化的模式，研究者对d.p.f. 25胚胎的神经管进行鉴定。发现在闭合的神经管背侧存在PAX3阳性细胞、腹侧存在FOXA2和NKX6.1阳性细胞，表明神经管顶板（roof plate）和底板（floor plate）的特化。此外，β-tubulin Ⅲ+/OLIG2+细胞标志着运动神经元祖细胞（progenitors of motor neurons）的特化；NKX2.2+/FOXA2+细胞标志着腹侧中间神经元祖细胞（progenitors of ventral interneuron 3）的特化。与闭合的神经管相比，OLIG2和NKX2.2未能在未闭合的神经管中检测到。这些分子表达特征与体内对应阶段胚胎的特征一致，表明pIVC胚胎可重现神经管沿背腹轴区域化发育的模式（图3）。

图3. pIVC胚胎神经管细胞的特化

除外胚层和神经管发育外，研究者还检测了pIVC胚胎中原始生殖细胞（primordial germ cells）和中、内胚层的发育特征。荧光染色结果显示，SOX17+/TFAP2C+/BLIMP1+细胞可在d.p.f. 22-24的胚胎后部腹侧被检测到，提示pIVC胚胎可发育出原始生殖细胞样细胞。在胚胎腹侧的位置还可检测到T+/CDX2+/OCT4+/Low或T+/TBX6+/SOX2-细胞，表明pIVC胚胎可发育出原条及其分化产物。此外，T⁺/TBX6⁺/SOX2⁺细胞的出现提示胚体存在类神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitor）或前体节中胚层细胞（presomitic mesoderm）的特化。另外，研究者可在pIVC胚胎的单细胞转录组数据中检测到MYL7、NKX2-5、HAND1和GATA4共表达的细胞，提示pIVC胚胎或存在心脏中胚层样细胞。单细胞多组学和荧光染色结果提示pIVC胚胎中可检测到OTX2+/FOXA2+/SOX17+细胞，表明胚胎已分化出定型内胚层（definitive endoderm）和卵黄囊（yolk sac）。与相同发育阶段的体内正常胚胎相比，pIVC胚胎的这些分子表达特征与正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重现原肠运动中晚期阶段中胚层和内胚层的发育。

研究者进一步利用单细胞多组学测序技术（单细胞转录组、DNA甲基化和染色质可及性测序，scChaRM-seq）8，对9个pIVC胚胎的3,850个单细胞的转录组和1,862个单细胞的DNA甲基化和染色质可及性进行测序和分析。结果提示，与本团队2022年在Nature杂志报道的相同发育阶段的食蟹猴胚胎单细胞转录组数据库相比9，pIVC胚胎可重现体内正常胚胎的转录组特征。DNA甲基化分析提示，pIVC胚胎各种细胞类型的基因均发生了甲基化，且胚胎组织的DNA甲基化水平（~75%）高于胚外组织（~50%），这与已报道的小鼠和人类胚胎特征相似2,10。

综上所述，本研究建立了可支持食蟹猴胚胎体外发育至d.p.f. 25的3D pIVC体系，基于该体系揭示了灵长类胚胎中晚期原肠运动至早期神经胚发育阶段胚胎的形态、细胞组分、转录组、DNA甲基化和染色质可及性等特征。该研究在已有体内研究的基础上进一步填补了灵长类胚胎中晚期原肠运动至早期器官发育阶段的领域空白，为灵长类胚胎体外培养和基于干细胞构建的“类胚胎”的体外培养提供了参考体系，为深入了解人类早期胚胎发育机制，以及早期胚胎发育异常相关疾病的病理研究提供了技术平台。

作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请王红梅研究员进行了专访，请她为大家进一步详细解读。

CellPress：

您的团队为何要开展食蟹猴胚胎的体外研究？

王红梅研究员：

人早期胚胎发育异常会导致出生缺陷等不良妊娠结局，例如先天性心脏病和神经管畸形等。因此，解析人早期胚胎发育特征，是从根源上解决出生缺陷，提高人口质量的重要前提。人的生命起始于受精卵，受精卵经过卵裂后形成囊胚，囊胚植入母体子宫后开启了漫长的宫内发育，其发育过程无法被直接探究。近年来，随着胚胎体外培养技术的发展，人类胚胎已经被培养到d.p.f. 14。但由于科研伦理限制，人类胚胎体外培养研究必须在d.p.f. 14终止。因此，体外培养的人类胚胎不能被用于研究发生于d.p.f. 14之后的原肠运动、神经管发育和心脏发育等重要事件。非人灵长类胚胎的发育特征与人类非常相似，是研究人类胚胎发育的重要模型。2019年我们团队和国际同行共同在Science杂志报道了食蟹猴胚胎体外发育到d.p.f. 20的研究，探究了灵长类胚胎从植入到早期原肠运动阶段的发育特征。为了进一步探索灵长类中晚期原肠运动和早期器官发育阶段的事件，我们建立了pIVC体系，它可以支持食蟹猴胚胎发育到d.p.f. 25。利用该体系，我们揭示了d.p.f. 20-25阶段胚胎发育事件，包括神经外胚层分化、神经管闭合、神经祖细胞分化、中胚层和内胚层特化等关键事件和分子特征。这两项连续性的食蟹猴胚胎的体外研究为我们深入了解灵长类早期胚胎发育机制，探究早期胚胎发育异常相关疾病提供了技术平台和理论参考。

CellPress：

这个体系与之前食蟹猴胚胎体外培养体系有何不同？

王红梅研究员：

之前我们将食蟹猴胚胎体外培养至d.p.f. 20的体系是一个2D-Matrigel体系。该体系能支持6.25%的胚胎发育至d.p.f. 20。利用这个体系培养的胚胎，其胚外组织发育旺盛，但内部的胚体发育效率较低。我们考虑这可能是由于胚外组织的过度发育影响了胚体的正常发育。因此，在优化体系的过程中，我们希望能一定程度上抑制胚外组织的发育，确保胚体能更多获得营养。新建立的pIVC体系是一个3D体系，这种体系基于低粘附96孔板和少量Matrigel而构建，可支持33.7％的胚胎发育到d.p.f. 20-25。在pIVC体系中，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体能维持发育，效率可达60%以上。

CellPress：

这项研究的下一步计划是什么？

王红梅研究员：

在未来的研究中，我们希望继续延长哺乳动物胚胎体外发育时程。为了实现这一目标，我们需要通过改进生物材料、培养基成分、静态或动态条件等方法进一步优化体系，以支持胚胎体外发育得更好更远。

作者介绍

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王红梅

研究员

王红梅，中国科学院动物研究所研究员，博士生导师。干细胞与生殖生物学国家重点实验室主任。北京干细胞与再生医学研究院副院长。国家杰出青年基金获得者。国家百千万人才工程“有突出贡献中青年专家”。主要研究方向：（1）哺乳动物早期胚胎和胎盘发生的细胞和分子机制；（2）干细胞与人类生育力的维持和重建。在Science，Nature，Nat Genet，Cell Res和Dev Cell等期刊发表研究论文及综述70余篇。

Nicolas Plachta

教授

Nicolas Plachta，宾夕法尼亚大学教授。于2015年加入“EMBO青年学者”；2016年被授予美国细胞生物学学会（ASCB）GIBCO新兴领袖奖；2017年成为霍华德休斯医学研究所（HHMI）国际学者。主要研究方向：（1）哺乳动物早期胚胎细胞命运决定；（2）利用实时成像等技术探索哺乳动物胚胎单细胞形态和运动轨迹，示踪细胞骨架在细胞命运决定中的核心作用，揭示早期胚胎细胞命运决定的动力学调控机制。在Cell，Nature和Science等期刊发表研究论文及综述30余篇。

郭帆

研究员

郭帆，中国科学院动物研究所研究员，博士生导师。国家优秀青年基金获得者。主要研究方向：（1）发育过程中的表观遗传编程与重编程；（2）细胞命运决定与转变过程中的表观遗传调控；（3）疾病演变与发展过程中的表观遗传基础。在Nature，Cell，Nat Genet，Cell Stem Cell和Cell Res等期刊发表研究论文及综述30余篇。

李伟

研究员

李伟，中国科学院动物研究所研究员，博士生导师。干细胞与生殖生物学国家重点实验室副主任。国家杰出青年科学基金、日本实验动物学会“国际奖”、中国科学院“青年科学家奖”、中国科学院杰出科技成就奖（突出贡献者）获得者。主要研究方向：（1）基因工程和干细胞等创新生物技术的研发；（2）利用新技术和模型揭示哺乳动物生殖与再生的基础调控规律；（3）重大疾病的基因治疗。在Science，Nature，Cell，Cell Stem Cell和Cell Res等期刊发表论文120余篇。获授权发明专利10余项。

翟晶磊

副研究员

翟晶磊，中国科学院动物研究所副研究员。先后在中国科学院动物研究所攻读博士学位和从事博士后研究工作。主要研究方向：（１）利用生物材料构建啮齿类和灵长类胚胎体外长时程培养体系；（２）利用胚胎培养体系研究灵长类动物原肠运动与早期器官发育核心事件；（３）构建灵长类早期胚胎和胚外组织单细胞多组学图谱等。以第一作者身份在Science，Nature，Dev Cell，Trends Cell Biol和Adv Sci等期刊发表研究论文及综述7篇。