物理所王立芬述评：定量分析冷冻电镜薄片样品的FIB损伤

原创 Cell Press CellPress细胞科学 

生命科学Life science

作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

2023年第二十四期（总第152期）专栏文章，由中国科学院物理研究所副研究员、中国科学院青年创新促进会会员 王立芬，就Cell Press细胞出版社期刊 Structure中的论文发表述评。

晶体学是一种用于确定晶体材料的原子和分子结构的基础技术。传统上，X射线衍射（XRD）和中子衍射一直是晶体学研究的主要方法。然而，冷冻电子显微镜（cryo-EM）作为一种强大的替代方法，与XRD和中子衍射相比，在晶体学中具有几个独特的优势。一方面，与需要晶体材料的XRD和中子衍射不同，cryo-EM可以研究复杂的大分子结构，如蛋白质和病毒，即使它们不形成完美的晶体。这种灵活性使研究人员能够在其原始状态下研究生物相关样品，从而揭示动态过程和构象变化，这对于理解生物功能至关重要。其次，冷冻电子显微镜已经证明在高分辨率下确定原子结构的能力，即使是对于大型的大分子组装体。随着硬件和软件的进步，cryo-EM可以达到传统晶体学方法难以实现的分辨率，使其成为研究大型生物复合物和膜蛋白的宝贵工具。虽然具有以上优势，但是冷冻电子显微镜需要最小的样品制备，从而大都需要借助于聚焦离子束减薄技术（FIB）实现样品制备。然而离子束在减薄样品的过程中，同样会引入难以避免的离子束损伤，如何降低损伤是实现冷冻电镜样品高分辨表征的关键前提。

近期，在一项发表于Structure期刊的重大研究中，中国科学院生物物理研究所的Xinzheng Zhang等人在减少聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样本时引入的损伤方面取得了重要进展。该研究使用高浓度病毒薄片作为模型样本（图1），对FIB损伤进行了定量分析。研究人员采用层析成像法测量蛋白质到薄片表面的距离，从而将蛋白质按照距离分组。随后，从每个组中随机选择相同数量的蛋白质进行三维重建。研究团队根据每个重建的傅里叶壳层相关（FSC）计算光谱信噪比（SSNR），以评估损伤程度（图2）。他们发现损伤在靠近薄片表面的地方逐渐增加，在距离10至20纳米的深度，SSNR减少了约80%。然而，在更深的区域，超过30纳米的深度，损伤与电子束引起的损伤相当（图3），这表明使用低能量离子束可能有助于减少损伤。

研究表明，通过使用低能量离子束进行制备，可以显著减少损伤深度，可能提高cryo-EM图像的分辨率和准确性。这一发现可能会为我们提供更深入了解细胞结构、蛋白质和病毒的微观细节，并有助于揭示多种疾病的机制，从而设计出更有效的治疗干预措施。虽然未来还需要继续深入研究来优化低能量离子束制备过程，但对于cryo-EM来说，通过最小化FIB损伤，研究人员当前可以揭示细胞结构、蛋白质和病毒的更多微观细节，为结构生物学领域带来突破性的发现。

▲图1 病毒薄片用于冷冻电镜单颗粒表征的制备方法。（A）Ga+聚焦离子束减薄后的病毒薄片转移到冷冻电镜中进行成像。（B）高浓度病毒的薄片的无偏转成像。▲图2 30-keV傅里叶壳层相关（FSCs）和光谱信噪比（SSNR）（A）不同距离组病毒块状重建的FSC图。从10到20纳米、20到30纳米、30到40纳米、40到50纳米、50到60纳米、60到70纳米、70到80纳米、80到90纳米和90到100纳米随机选择的90,000个亚粒子，分辨率分别达到4.05 Å，3.88 Å，3.82 Å，3.62 Å，3.60 Å，3.57 Å，3.57 Å，3.60 Å和3.57 Å。（B）通过每个距离组的FSC计算的SSNRn，并以60到70纳米组的SSNR作为参考SSNRr。SSNRn / SSNRr表示SSNR的降低。。▲图3 不同深度层的电子预暴露模拟的傅里叶壳层相关（FSCs）和等效电子剂量。（A）使用前十帧的FSC（实线）和电子预暴露模拟FSC（虚线）对不同距离组的重建进行比较。（B）不同距离组中的电子预暴露剂量。

论文摘要

聚焦离子束（FIB）广泛用于稀释冷冻细胞，以制备用于冷冻电子显微镜成像和蛋白质结构研究的薄片。然而，FIB会损伤薄片，并且对损伤的定量实验分析尚缺乏。我们使用30-keV镓离子束制备了高浓度二十面体病毒样品的薄片。根据病毒与薄片表面的距离进行分组并进行重建。大约20纳米厚的最外层薄片表面的损伤与在300-kV冷冻电子显微镜中暴露到16 e-/A⊃2;时的高分辨率范围内的电子束损伤类似。在50纳米深度之外的损伤微乎其微，如果在抛光过程中使用8-keV镓离子束，深度可降至30纳米。我们在重建精修过程中设计了额外的步骤，以最大程度地增加未受损信号并提高分辨率。结果表明，低能量束抛光对于获得高质量的较薄薄片至关重要。

Focused ion beam (FIB) is widely used for thinning frozen cells to produce lamellae for cryo-electron microscopy imaging and for protein structures study in vivo. However, FIB damages the lamellae and a quantitative experimental analysis of the damage is lacking. We used a 30-keV gallium FIB to prepare lamellae of a highly concentrated icosahedral virus sample. The viruses were grouped according to their distance from the surface of lamellae and reconstructed. Damage to the approximately 20-nm-thick outermost lamella surface was similar to that from exposure to 16 e/Å2 in a 300-kV cryo-electron microscope at high-resolution range. The damage was negligible at a depth beyond 50 nm, which was reduced to 30 nm if 8-keV Ga+ was used during polishing. We designed extra steps in the reconstruction refinement to maximize undamaged signals and increase the resolution. The results demonstrated that low-energy beam polishing was essential for high quality thinner lamellae.

向下滑动阅览摘要原文

中文内容仅供参考，请以英文原文为准

述评人简介

王立芬

中国科学院物理研究所 副研究员

中国科学院青促会会员

王立芬， 2014年毕业于中国科学院物理研究所；2014-2018年任美国阿贡国家实验室博士后研究员；2020年入选中科院青促会会员；担任Chinese Physics Letters、Chinese Physics B、Acta Physica Sinica、Physics期刊青年编委。目前已在Nature、Nature Materials、Phys. Rev. Lett.、Angew. Chem. Int. Ed.等期刊发表论文40余篇。

Dr. Lifen Wang graduated from the Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences in 2014; served as a postdoctoral researcher at Argonne National Laboratory from 2014 to 2018; selected as a member of the Hundred Talents Program at the Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences in September 2018; became a member of the Youth Promotion Association of the Chinese Academy of Sciences in 2020; currently serving as a young editorial board member for journals such as Chinese Physics Letters, Chinese Physics B, Acta Physica Sinica, and Physics. She has published over 40 papers in journals such as Nature, Nature Materials, Phys. Rev. Lett., Angew. Chem. Int. Ed., etc.

中国科学院青年创新促进会（Youth Innovation Promotion Association，Chinese Academy of Sciences）于2011年6月成立，是中科院对青年科技人才进行综合培养的创新举措，旨在通过有效组织和支持，团结、凝聚全院的青年科技工作者，拓宽学术视野，促进相互交流和学科交叉，提升科研活动组织能力，培养造就新一代学术技术带头人。

Youth Innovation Promotion Association (YIPA) was founded in 2011 by the Chinese Academy of Science (CAS). It aims to provide support for excellent young scientists by promoting their academic vision and interdisciplinary research. YIPA has currently more than 4000 members from 109 institutions and across multiple disciplines, including Life Sciences, Earth Science, Chemistry& Material, Mathematics & Physics, and Engineering. They are organized in 6 discipline branches and 13 local branches.

阅读原文