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Cell Reports Methods：邹鹏课题组报道基于荧光成像的蛋白质定向进化方法

2023-08-22 11:43

来源：澎湃新闻·澎湃号·湃客

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原创 Cell Press CellPress细胞科学

生命科学

Life science

2023年7月27日，北京大学邹鹏课题组在Cell Press细胞出版社期刊Cell Reports Methods发表题为“Functional imaging-guided cell selection for evolving genetically encoded fluorescent indicators”的研究论文，报道了基于荧光成像的定向进化方法Faculae。Faculae可在哺乳动物细胞中高效稳定构建突变体文库，在显微镜下针对混合细胞文库中的优势表型细胞进行快速光激活选择，该工作用Faculae实现了遗传编码远红色钙探针的多维度表型筛选与定向进化。北京大学邹鹏研究员为论文通讯作者，林畅为论文第一作者。该工作得到了北大-清华生命科学联合中心、科技部、国家自然科学基金委的资助。

相关背景

遗传编码荧光探针通常由荧光蛋白与其他蛋白质片段连接构成，能够响应特定生物分子或者细胞生理过程，并将其转换为荧光信号。为优化荧光探针性能，研究者往往需要针对突变体不断测试筛选和迭代进化。荧光探针定向进化的难点在于需要考虑多种荧光表型参数，包括荧光强度和动态响应幅度等，因此无法直接通过流式分选方法进行测试筛选，而常用的多孔板阵列文库成像筛选存在通量较低(~103)的局限性，因此研究者认为可以开发一种基于荧光成像的混合细胞文库鉴定、选择方法，在保留多筛选维度的同时提高筛选通量、扩大蛋白质序列的搜索空间（图1）。

图1 Faculae方法流程示意图

结果解读

1.设计和实现基于荧光显微成像的细胞选择平台Faculae

基于成像的细胞选择平台需要实现显微镜下目标细胞群表型和基因型的对应。区别于此前常用的基于数字微镜阵列的空间光照明方法，本文中Faculae平台采用聚焦光斑照明，通过物镜会聚405 nm紫光，在样品焦平面形成直径小于20 μm的光斑，以单细胞分辨率激活胞内光敏荧光蛋白PAmCherry。得益于聚焦光斑的高功率密度，Faculae平台激活每个细胞仅需1~2秒。激活后的细胞带有红色荧光标签，可以通过流式分选进行高纯度回收（图2）。

图2 通过Faculae实现显微镜下目标细胞选择性光激活与回溯

接下来，研究者使用Faculae平台对远红色荧光蛋白miRFP680进行模式筛选。首先，研究者使用基于重组酶的细胞“停机坪”(cell landing pad)方法在HEK293T细胞中构建miRFP680的双位点组合饱和突变体文库，在显微镜下成像筛选4×104个细胞并光激活荧光强度相对较高的细胞，通过FACS回收后扩增测序。测序结果表明，最优势突变体占比明显高于其他突变体，高达71%，该实验结果表明Faculae可以从显微镜下的突变体文库中富集具有期望表型的细胞（图3）。

图3 在哺乳动物细胞中通过Faculae筛选远红色荧光蛋白miRFP680

2. 对远红色荧光钙探针进行多维度定向进化

远红色荧光钙探针是由远红色荧光蛋白和钙结合结构域组成的钙成像工具，具有广泛的应用前景，然而其荧光强度和对钙荧光响应幅度仍然需要优化提升。为了同时评估远红色荧光钙探针突变体的亮度与响应幅度，研究者设计了离子霉素/氯化钙/2-氨基乙氧基二苯基硼酸盐的加药策略，能够平稳提高细胞内钙离子浓度，该加药策略可以成功区分具有不同响应幅度的现有钙探针（NIR-GECO2G与NIR-GECO1）。研究者将高低响应的荧光探针按照1:20的比例混合，通过Faculae平台进行双参数筛选（亮度与响应幅度），光激活选择同时具有高亮度与高响应的细胞进行回收测序。测序结果表明高响应探针回收后占比高达93%，以上实验结果表明Faculae可以实现对钙探针的双参数评估筛选。

图4 基于Faculae的荧光钙探针多参数评估策略

研究者参考此前钙探针的突变位点设计了两个随机组合突变文库，并通过Faculae筛选每个文库，筛选富集后部分位点突变率明显高于其他位点。将具有高突变率的三个位点重新组合饱和突变后筛选，可以得到一系列性能优于模板的突变体，荧光强度分布在1.3倍到3.4倍之间，荧光响应分布在0.73倍到1.5倍之间。

图5 通过Faculae筛选NIR-GECO突变体

研究者将新获得的远红色钙探针突变体表达在离体培养的海马体神经元中，并通过荧光成像和电生理实验表征探针亮度以及对动作电位的响应幅度。结果发现突变体Nier1s（NIR-GECO2G-133Q/302K/466M）相比于模板的单个动作电位响应提升到2倍，而突变体Nier1b（NIR-GECO2G-133E/302T/466C）的亮度提升到1.9倍，且它们的动力学参数与模板基本保持一致，以上实验结果表明Nier1s和Nier1b是相比于模板性能更优的突变体（图6）。

图6 通过Faculae筛选得到的远红色钙探针Nier1s和Nier1b在神经细胞中分别具有更高响应和更高亮度

为了展示Faculae筛选的便捷性，研究者在Nier1s的骨架上进一步突变筛选，并进行一轮迭代。在第一轮筛选中，约2000个细胞被光激活，单个细胞平均激活时间为1.5秒，目标细胞被回收后扩增建库，送入第二轮筛选。在第二轮筛选中，研究者成功鉴定到了表型优于Nier1s的突变体，以上实验结果表明Faculae可以在哺乳动物细胞中实现快速的成像迭代筛选。

图7 实现基于Faculae的迭代筛选

总结

由于Faculae方法能够在哺乳动物细胞中高效构建突变体文库，并在显微镜下鉴定细胞表型和快速选择细胞，该方法为进化荧光探针、化学遗传学元件和光遗传学元件等蛋白质工具提供了新思路。与此同时，该方法也提供了一种在显微镜下简单、快速选择多个目标细胞的新策略，已成功应用于纯化多能干细胞向心肌细胞分化过程中的中间态细胞1。

本文参考文献

[1] Yang, X., Chen, D., Sun, Q. et al. A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems. Cell Discov 9, 53 (2023).

作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者邹鹏研究员代表团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。

CellPress：

您的团队为什么会开发这样一个定向进化平台？

邹鹏研究员：

我们的团队长期致力于发展荧光探针，实现在高时空分辨下对神经活动的可视化观测。然而传统基于理性设计的蛋白质工程改造耗时久、通量低，已经成为制约探针技术发展的瓶颈。我们迫切需要一种适用于哺乳动物细胞体系的高通量定向进化平台。Faculae平台的构想是在这个背景下提出，作为一个基于荧光成像的定向进化平台，加速荧光探针的改造进程。

CellPress：

您认为该研究的亮点是什么？

邹鹏研究员：

首先，Faculae是一个基于哺乳动物细胞的定向进化系统，能够直接在哺乳动物细胞中高通量评估突变体性质，筛选时的细胞环境与蛋白质工具的实际使用环境最为接近，相比于细菌和酵母筛选表型更为可靠，同时也可以筛选仅哺乳动物细胞可以正确发挥功能的蛋白质，例如G蛋白偶联受体、视紫红质等膜蛋白。其次，该技术的特点在于可以利用荧光成像评估细胞内荧光信号的动态变化信息和亚细胞定位信息等，能够获得蛋白质工具的复杂表型，这一点使这个平台非常适合于筛选荧光探针、光遗传学元件等蛋白质工具。

CellPress：

您团队有何进一步的研究计划？

邹鹏研究员：

荧光膜电位探针是指示大脑神经活动的重要成像工具，但是筛选起来十分困难，往往难以提升其表现。接下来我们计划将Faculae平台应用到膜电位探针的筛选中，加速膜电位探针的性能优化，开发出适用于活体成像的高信噪比膜电位探针。

作者专访

邹鹏

研究员

邹鹏，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、合成与功能生物分子中心、北大IDG/麦戈文脑科学研究所研究员。围绕神经化学生物学开展交叉学科研究，长期致力于发展具有时空分辨能力的新型化学探针工具，开展神经细胞信号传导过程及调控机制的研究。获中国化学会生命化学奖，美国化学会C&EN Talented 12奖，中美华人化学及化学生物学教授协会OKeanos-CAPA青年学者奖。担任Bioconjugate Chemistry主题编辑，Biochemistry编委。