【学术前沿】专家点评NCB丨赵小阳/高帅/常港合作揭示人类精子发生过程中的全局性DNA去甲基化参与…

点评 | 史庆华（中国科学技术大学）、汤富酬（北京大学）、童明汉（中科院分子细胞科学卓越创新中心）

精子发生是雄性配子产生的基础，这一发育过程受到精密调控。基因突变或表观遗传变异均能够影响精子发生，进而导致雄性不育【1,2】。解析人类精子发生过程中的细胞命运调控机制，对于实现人类精子的体外再生，以及男性不育疾病的临床诊断和治疗具有重要意义。

2018年，赵小阳团队、常港团队联合乔杰院士团队和汤富酬团队，首次揭示了人类精子发生中的细胞命运转变过程，并发表在Cell Stem Cell杂志上（详见BioArt报道：Cell Stem Cell丨赵小阳/乔杰/汤富酬合作组报道人类精子发生过程中的基因表达调控网络与细胞命运转变路径）。人类精子发生过程中细胞命运转变背后的表观调控机制是什么？人类精子发生中是否存在尚未被发现的重要表观调控事件？这一直是本领域中亟待回答的重要科学问题。

2023年9月18日，南方医科大学赵小阳团队、中国农业大学高帅团队和深圳大学常港团队在Nature Cell Biology杂志发表题为Single-cell multi-omics sequencing of human spermatogenesis reveals a DNA demethylation event associated with male meiotic recombination的研究论文。该研究利用单细胞多组学技术从染色质可及性、DNA甲基化以及基因表达等三个维度，系统揭示了人类精子发生过程中细胞命运转变的表观调控机制，发现人前细线期精母细胞（preleptotene）中发生的全局性DNA去甲基化参与调控减数分裂重组，且这一过程在人和小鼠中高度保守，干预这一轮DNA去甲基化过程会影响雄性减数分裂DNA双链断裂（double stand break, DSB）的形成。

该研究首先利用优化的单细胞多组学技术（modified single-cell chromatin overall omic-scale landscape sequencing approach, modified scCOOL-seq）对来自4例正常成年男性的1097个睾丸细胞进行测序分析，实现了在单个细胞中同时检测染色质可及性、DNA甲基化以及基因表达三个维度的信息，建立了高精度的多组学数据集。通过对已建立的数据集进行深度分析，研究人员发现人类精子发生过程中的基因表达变化主要与染色质可及性相关，基于此，研究人员预测出了13183个远端顺式调控元件和多个具有潜在功能的转录因子。随后，研究人员通过荧光素酶报告系统及基因干预实验证实了多个候选元件的调控功能。

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，参与早期胚胎发育、配子发生、基因印记及X染色体失活等多个生物学过程。迄今为止，领域内公认的是，在哺乳动物生殖系的建立和发育过程中先后共经历了两轮大规模的DNA去甲基化过程，分别发生在受精完成之后和原始生殖细胞的迁移过程中【3】。在本研究中，研究人员基于数据分析，发现人前细线期精母细胞中存在一轮尚未被发现的全局性DNA去甲基化过程。利用多个睾丸组织样本验证了前细线期精母细胞中发生了DNA去甲基化，转录组及染色结果显示UHRF1（DNA甲基转移酶DNMT1的分子伴侣）【4】的动态表达模式与DNA甲基化水平变化趋势高度吻合，初步猜测这是由于DNA甲基转移酶活性降低导致的被动去甲基化过程。

为了探究这一轮全局性DNA去甲基化的生物学意义，研究人员对DNA去甲基化区域进行了富集分析，发现去甲基化区域很少分布在启动子、增强子等基因调控区域，而是显著富集在人类重组热点和减数分裂DSB热点。同时，DNA去甲基化区域显著富集PRDM9结合基序。PRDM9是目前公认的减数分裂DSB决定的关键调控因子【5】。以上结果提示，这一轮全局性DNA去甲基化过程与基因表达无关，很可能与减数分裂重组的调控有关。通过对小鼠睾丸组织进行免疫荧光染色，并分选小鼠的前细线期精母细胞、精原细胞和粗线期精母细胞，利用亚硫酸盐联合限制性内切酶分析（COBRA）以及bisulfite-PCR sequencing对重组热点的DNA甲基化水平进行分析，证实这一轮DNA去甲基化事件在人和小鼠中高度保守。为进一步确认这一轮DNA去甲基化在减数分裂的哪个阶段发挥功能，研究人员分别利用Prdm9敲除雄鼠和Top6bl（DSB形成必须蛋白）敲除雄鼠进行研究，发现无论是Prdm9敲除还是Top6bl敲除均不影响这一轮DNA去甲基化的发生，证明DNA去甲基化在PRDM9的上游发挥功能，即发生在雄性减数分裂DSB的决定和形成之前。

那么，这一轮全局性DNA去甲基化是否与不育症的发生存在某些关联？为了回答这一问题，研究人员分别获取了2例非梗阻性无精症患者（NOA）的176个和130个睾丸细胞，并进行了单细胞多组学分析。通过对数据的深度挖掘和染色验证，发现这两例无精症患者细线期精母细胞的DNA甲基化水平高于正常人，其中，异常高甲基化区域显著富集在重组热点、减数分裂DSB热点以及PRDM9结合基序。通过整合另外7例无精症患者的单细胞转录组数据，研究人员在44.4%的NOA病例中检测到了DNMT1的表达上调，而在11.1%的NOA病例中能够检测到UHRF1的表达上调。以上结果提示，维持性DNA 甲基化调控异常可能与不育症的发生存在一定的关联。

为了进一步验证干预这一轮全局性DNA去甲基化是否会影响雄性减数分裂重组，研究人员首先使用DNA甲基化抑制剂decitabine处理HEK293T细胞，发现decitabine处理组中异常低甲基化重组热点周围的PRDM9结合信号明显升高，表明DNA甲基化水平降低能够促进PRDM9的结合。进一步通过利用Stra8-Cre;Uhrf1flox/flox条件性敲除小鼠，研究人员发现Uhrf1敲除不但能够引起雄鼠不育，还会导致细线期及偶线期精母细胞中DSB标志物DMC1和RAD51数目的显著增加。最后，研究人员分别建立了UHRF1过表达和UHRF1-DNMT1过表达的小鼠精原干细胞系，进而移植到Kitw/wv不育小鼠的睾丸曲细精管中，通过分析发现，无论是UHRF1过表达还是UHRF1-DNMT1过表达引起的全局性DNA甲基化水平轻度升高，都会导致偶线期精母细胞中DSB数量的显著减少。与对照相比，UHRF1过表达组减少约24%至30%，而UHRF1-DNMT1过表达组减少约90%。此外，移植UHRF1过表达组的小鼠睾丸中精子细胞数量明显减少，而移植UHRF1-DNMT1过表达组的小鼠睾丸中几乎检测不到精子细胞。以上结果表明，干预DNA去甲基化能够影响雄性减数分裂DSB的形成。

综上所述，该研究系统建立了人类精子发生过程中的高精度染色质可及性、DNA甲基化及转录组数据集，首次发现雄性减数分裂启动阶段发生的全局性DNA去甲基化参与减数分裂重组的调控，干预这一过程会影响雄性减数分裂DSB的形成。这将为深入研究人类精子发生的调控机制以及男性不育疾病的临床诊断和治疗提供新的方向和线索。

南方医科大学赵小阳教授，中国农业大学高帅教授和深圳大学常港研究员为本文的共同通讯作者。南方医科大学黄亚萍博士，李琳教授，广州医科大学附属第三医院安庚教授，南方医科大学杨昕衍博士研究生、崔曼曼博士研究生为本文的并列第一作者。

附招聘信息：

南方医科大学赵小阳课题组博士后招聘：硕博连读生和博士后深圳大学医学部常港课题组现招聘：博士后（干细胞或生殖发育相关专业优先）

专家点评

史庆华（中国科学技术大学）

减数分裂是包括人类在内的所有有性生殖生物的最基本特征，其正常进行是保证配子产生和遗传多样性的关键，主要包括同源染色体的配对、联会和重组。减数分裂重组起始于细线期和偶线期程序性DNA双链断裂（DSB）的产生。减数分裂DSB不是随机分布在基因组中，而是主要分布在某些区域（即DSB热点）【6】。之前的研究认为PRDM9是决定减数分裂 DSB 位点的关键调节因子，但决定 PRDM9 定位并催化H3甲基化的因子却不清楚。由于人类精子发生过程中的生精细胞种类繁多，且缺乏特异的细胞标志物能用于分离纯化不同亚阶段的生精细胞，以致对精子发生过程中系统性的表观修饰变化知之甚少。

该研究利用单细胞多组学技术，通过转录组数据确定每个细胞的身份（发育亚阶段），揭开了人类生精细胞命运转变过程中表观调控机制的黑匣子。预测的顺式作用元件和转录因子对人类生殖发育的调控机制研究提供了重要线索。尤为重要的是，该研究首次发现在人类前细线期精母细胞中发生了一轮全局性DNA去甲基化。事实上，曾有两篇论文报道过哺乳动物的减数分裂启动阶段存在DNA去甲基化现象，但这其中的生物学涵义并不清楚【7,8】。有意思的是，南方医科大学赵小阳课题组、中国农业大学高帅课题组和深圳大学常港课题组综合运用生物信息学手段和基因敲除小鼠等，揭示了前细线期精母细胞的DNA去甲基化发生在PRDM9结合之前，对PRDM9在染色质上的募集有重要促进作用，从而参与了减数分裂DSB位点的决定和重组调控。研究人员从多个层面证实DNA去甲基化对减数分裂重组的调控作用，包括经DNA甲基化小分子处理后细胞内PRDM9结合的变化，利用正反向干预DNA甲基化的小鼠模型（Uhrf1条件性敲除小鼠、UHRF1过表达及UHRF1-DNMT1过表达移植小鼠）研究DNA甲基化状态对减数分裂DSB数目的影响。此外，该研究发现在非梗阻性无精症患者的前细线期精母细胞中存在异常的DNA高甲基化现象，并且富集在重组热点和减数分裂DSB热点，这表明有一部分患者的不育可能与这轮DNA去甲基化的异常相关。该研究对于深入理解人类精子发生的表观调控，特别是减数分裂重组的调控机制，有重大促进作用，也为相关男性不育症的诊疗方法的研发提供了重要的科学依据。

专家点评

汤富酬（北京大学生物医学前沿创新中心）

精子发生是一个独特、复杂、受到严密调控的多阶段发育过程，包括有丝分裂、减数分裂以及精子形成三个主要生物学事件。然而受限于精子发生过程中生精细胞类型的多样性，以及精子发生过程的异步性，很难获取处于特定发育阶段的高纯度生精细胞类型，因此精子发生过程中的很多核心生物学事件的分子机制难以得到深入阐释，特别是人类精子发生过程中的表观遗传调控机制更难研究。近年来，随着单细胞多组学测序技术的发展，使得对这些问题的系统、深入研究成为可能。

近日，南方医科大学赵小阳团队、中国农业大学高帅团队与深圳大学常港团队合作，通过将优化的单细胞多组学测序技术scCOOL-seq（对一个单细胞同时进行DNA甲基化组、染色质状态组以及转录组测序），对成年男性的睾丸组织细胞进行测序分析，在单细胞分辨率绘制了人类精子发生过程中的高精度单细胞DNA甲基化组、染色质状态组以及转录组图谱，揭示了染色质状态在精子发生过程中对基因表达的调控规律，同时还系统鉴定了在人类精子发生过程中对细胞命运转变具有潜在重要调控功能的顺式调控元件以及对应的关键转录因子，最后发现在精子发生过程中的减数分裂开始阶段存在一轮大规模DNA去甲基化现象，并且这一过程促进了减数分裂重组，也为进一步理解人类精子发生过程中的表观遗传调控机制提供了宝贵的高精度高分辨率组学数据资源。在哺乳动物发育过程中，着床前胚胎和胚胎期生殖细胞发育过程中会经历两轮大规模全基因组DNA甲基化重编程过程。但一般认为，睾丸生殖细胞的DNA高甲基化状态在减数分裂前已完成，并且在精子发生过程中基本维持不变。而该项研究发现在精子发生过程中的减数分裂开始阶段，发生了又一轮DNA去甲基化（去甲基化幅度高达20%），并且伴随着DNA甲基化调节因子UHRF1表达的减少。之前也有研究报道减数分裂开始时伴随着DNA甲基化水平的降低，但是DNA去甲基化和减数分裂重组之间的调控关系并不清楚。而该项研究进一步明确了这一轮DNA去甲基化很可能促进了减数分裂重组，而且去甲基化事件先于PRDM9的结合和DSB的形成。并且这一现象在人类和小鼠之间是保守的。此外在非梗阻性无精症患者的细线期精母细胞中鉴定到了减数分裂重组热点存在异常DNA超甲基化现象，并且伴随着DNA甲基转移酶DNMT1和 调节因子UHRF1 转录本的上调。该合作团队通过充分利用小鼠模型的优势，进一步深入分析UHRF1敲除和UHRF1-DNMT1过表达后小鼠睾丸细胞的发育表型，结果都表明改变这轮DNA去甲基化会显著影响减数分裂DSB的形成以及雄性生育力。这说明UHRF1和DNMT1通过表达水平下降调控这轮DNA去甲基化，进而调控减数分裂DSB的形成，并在雄性生育力维持中发挥重要作用。

该研究通过深入探究人类精子发生过程中的DNA甲基化、染色质可及性等层面的表观遗传修饰变化、基因表达变化及其具体调控机制，并结合小鼠模型，证实了在精子发生过程的减数分裂前存在一轮大规模DNA去甲基化过程，并明确了DNA去甲基化对减数分裂重组的关键调控作用以及具体调控机制。该研究也从表观遗传调控变化的角度揭示了非梗阻性无精症患者生精障碍的潜在发病机制，为进一步开发相关分子诊断和临床治疗方案提供了新的视角。总之这是人类生殖发育与生殖疾病领域的又一重大突破。

专家点评

童明汉（中科院分子细胞科学卓越创新中心）

哺乳动物精子发生是一高度复杂并受到严密调控的发育过程。其产生的单倍体精子，通过与卵子结合，产生全能性的合子 (zygote)，将父本基因组和表观遗传组信息传递至子代，最终使生命得以一代代传序。在精子发生过程中，雄性生殖细胞经历了包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性 (chromatin accessibility) 以及染色质三维结构等在内的一系列有序的表观遗传修饰重构，以影响基因时空特异性表达、DNA重组和染色质重塑等，从而确保产生有功能的精子，实现遗传物质和表观遗传信息的正确传递。上述成果的获得多数基于模式动物—小鼠的研究，源自于人的很少。赵小阳团队及其合作者在该项研究中，应用单细胞多组学技术绘制了人精子发生的染色质可及性、DNA甲基化和转录组的动态变化图谱，为人类精子发生研究提供了基础数据，将助益人精子发生体外重构，以及男性不育和男源性胚胎发育障碍的诊治。

该研究有两项重要发现。首先，文章首次揭示了人和小鼠精子发生过程中的表观调控机制，包括基于染色质可及性预测的基因远端调控元件和相关转录因子，以及人和小鼠高度保守的DNA甲基化变化特征和功能。在人类生精细胞难以获取、体外精子发生体系尚未建立的情况下，该发现为应用小鼠模型研究人类精子发生及其调控机制提供了重要依据。其次，作者发现UHRF1下调所致的维持性DNA甲基化活性降低，造成了前细线期精母细胞去甲基化；而这些去甲基化区域主要富集于减数分裂DSB热点并富含PRDM9结合元件，提示其与减数分裂DSB位点选择和DSB形成相关；细胞学和遗传学实验进一步证明，干预DNA去甲基化可影响DMC1 foci（DSB细胞学标志物）数量，表明发生于前细线期精母细胞的被动去甲基化可能参与了减数分裂同源重组。这一发现将为主要由PRDM9介导的DSB热点选择机制研究提供新的视角。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41556-023-01232-7

参考文献

1. M. A. Handel, J. C. Schimenti, Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet 11, 124-136 (2010).

2. M. Godmann, R. Lambrot, S. Kimmins, The dynamic epigenetic program in male germ cells: Its role in spermatogenesis, testis cancer, and its response to the environment. Microsc Res Tech 72, 603-619 (2009).

3. M. Saitou, S. Kagiwada, K. Kurimoto, Epigenetic reprogramming in mouse pre-implantation development and primordial germ cells. Development 139, 15-31 (2012).

4. J. Sharif et al., The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmt1 to methylated DNA. Nature 450, 908-912 (2007).

5. K. Brick, F. Smagulova, P. Khil, R. D. Camerini-Otero, G. V. Petukhova, Genetic recombination is directed away from functional genomic elements in mice. Nature 485, 642-645 (2012).

6. F. Baudat, Y. Imai, B. de Massy, Meiotic recombination in mammals: localization and regulation. Nat Rev Genet 14, 794-806 (2013).

7. Y. Chen et al., Refined spatial temporal epigenomic profiling reveals intrinsic connection between PRDM9-mediated H3K4me3 and the fate of double-stranded breaks. Cell Res 30, 256-268 (2020).

8. V. Gaysinskaya et al., Transient reduction of DNA methylation at the onset of meiosis in male mice. Epigenetics Chromatin 11, 15 (2018).

原标题：《【学术前沿】专家点评NCB丨赵小阳/高帅/常港合作揭示人类精子发生过程中的全局性DNA去甲基化参与减数分裂重组的调控》

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