脑声常谈：动物行为与光电专题丨联合型学习中的在体电生理记录

实验开始1周之前，进行头部固定手术，将用于头部固定的金属头片与颅骨粘合。本实验中定制的金属头片是一个中间开口4mm×7mm的钛合金平板，平板底面切割出贴合小鼠颅骨的弧面，方便两者的粘连。手术过程如下：首先腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，用剪刀或脱毛膏去除小鼠颅顶毛发后，将动物固定于立体定位仪上（注意不要破坏听觉系统）。使用75%消毒酒精、碘酒清理皮肤表面，剪开皮肤后暴露颅骨，可适当去除眼睛后缘到耳朵前缘范围内的皮肤，方便金属头片贴合颅骨。接下来，使用浓度为3%的双氧水反复擦拭颅骨表面，氧化并用棉球擦除结缔组织，保证颅骨表面干净。在立体定位仪上调平颅面后，按照坐标标记目标脑区（背侧CA1：前囟后开2.2mm；中缝旁开1.6mm），方便后期实验操作。将金属头片放置与颅骨表面，来回滑动立体定位仪针头保证金属头片左右、前后水平，在金属头片与颅骨连接处滴入适量组织胶水，保证头片与颅面充分粘合，并将皮肤边缘粘合防止感染。待组织胶水凝固后，卸下小鼠，腹腔注射4万单位青霉素，将其放置于温箱保暖，待小鼠苏醒后放回饲养笼恢复。

电生理记录前一天，将小鼠在实验台上头部固定，小鼠使用1.5%异氟烷吸入麻醉，使用牙科钻配0.5mm钻头在定位位点轻打出直径约0.8mm的记录孔与位于右侧前额叶的直径0.5mm的参比孔，将记录孔与参比孔蜡封保护。将小鼠放置于温箱保暖，清醒后放回饲养笼。电生理记录当日，采集信号前，实验台上将小鼠头部固定，使用自制的钨丝针在体式显微镜下清除骨膜与硬脑膜，使用生理盐水保持记录孔湿润等待记录。

行为学装置

与头部固定小鼠的痕迹型奖赏性联合学习配套的行为系统，主要包括头部固定系统、行为控制系统与信号采集系统。头部固定系统主要由转盘与头部固定支架构成，头部固定的小鼠可以在转盘上跑动，带动转盘旋转。

行为控制系统由控制中心单片机操纵声音装置与给水装置。声音装置为一套音响，放置于小鼠头前两侧。给水装置由微型电磁阀作为给水开关，给水管道系统靠重力实现给水，当微型电磁阀接收到单片机命令打开时，出水针头出水，每次出水水量可通过调整微型电磁阀打开时长控制。给水装置配有以微型泵为核心的撤水系统，同样由单片机控制，可以吸取出水针头残留水滴。

信号采集系统主要由红外探头构成，红外探头放置于给水针头的两侧，可以探测到小鼠的舔水动作。红外探头检测到的行为信号接入单片机，与单片机控制声音信号、给水信号和吸水信号可通过计算机对行为信号实时展示与单独记录。这些信号也可由并行线路接入电生理记录系统进行行为学信号打标。

行为学流程

痕迹型奖赏性联合学习的行为学实验过程共包括三个阶段：习惯化（habituation）、条件化训练（conditioning）和检测（testing）阶段。

行为学流程示意图

行为学流程包括4天（Day1-4）的习惯化、1天（Day5）的条件化训练与1天（Day6）的检测，在习惯化前1天（Day0）将小鼠断水。Water withdrawal：断水；Habituation：习惯化；Conditioning：条件化训练；Testing：检测。

习惯化阶段持续四天（Day1-4），该阶段包括小鼠对实验人员、头部固定与行为装置汲水的适应。习惯化开始前一天（Day0）将小鼠断水。习惯化期间，首先由实验人员抚触（handling）小鼠15min，消除其紧张情绪小鼠出现洗脸行为（grooming）表明它处于放松状态。接下来将小鼠头部固定在实验台上，高度适宜，使其适应头部固定状态与实验环境3-4h。适应头部固定后小鼠回笼休息0.5-1小时，再次将小鼠头部固定并使其通过给水装置汲水。给水装置每间隔9-15s给水一次，一次出水约4μL，持续给水至小鼠不再舔水。本实验中，小鼠与给水水头的相对位置均保证小鼠无法直接通过胡须或嗅觉等方式感受到水，首次汲水时需实验人员引导。汲水结束后小鼠回笼，保持断水与自由进食。条件化训练当天（Day5），小鼠经实验人员抚触后，不再进行头部固定状态的适应，保持体力。将小鼠头部固定于实验台后，直接开始条件化训练。训练过程中，CS与US配对出现，相邻配对起始的间隔为9-15s。其中，CS为中性声音刺激（8000Hz，75dB，100ms）；US为水奖赏，给水后1.5s吸走；CS结束到US起始间隔1.2s。直到小鼠不再喝水，条件化训练结束。小鼠回笼，保持断水与自由进食。条件化训练次日（Day6）检测小鼠对CS-US配对的记忆。小鼠经实验人员抚触后头部固定，仅给与20次CS，CS起始间隔9-15s。

急性多通道记录和信号采集

急性多通道记录在小鼠条件化训练当日（Day5）进行。习惯化结束当天（Day4）需进行记录开孔。多通道信号由RHD2000记录系统采集，采样频率30kHz，储存后用于线下分析。CS、US等行为学信号接入记录系统一并采集储存。两个行为表现参数用于分析，条件反应指数（conditioned response index，CRI）和相对条件反应值（relative conditioned response index，rCRI）。前者用于实验动物个体对应数据的分析，后者用于跨个体数据分析。以声音刺激前4s为错误窗口（EW，error window），声音刺激起始后1.3s（即CS时长与trace时长）为正确窗口（CW，correct window）统计舔水频率，CR定义如下：CRI=RCW-REW。其中，RCW（ratein correct window）为正确窗口内舔水频率，REW（ratein error window）为错误窗口内舔水频率。

相对条件化反应指数

在条件化反应指数的基础上，进行均一化。小鼠在某段行为中最优表现为CS前不舔水，仅在CS后舔水，该段CRI可能的最大值即正确窗口舔水动作频率。因此，将每个block内的rCRI均值定义如下：难度适中的奖赏型联合学习范式。小鼠能够在适宜时长内完成联合型学习，既方便实验中单次、完整采集学习过程神经元信号，也适于编码过程的分析。

行为学范式

在该范式中，头部固定的小鼠放置于由脚部转盘、嘴前水头和头朝向两侧的喇叭构成的行为学装置中，进行声音和水配对的联合型学习。小鼠联合学习训练前，首先经历4天抚触和头部固定的自由汲水以适应实验人员以及实验装置。在第5天小鼠进行训练，学习声音与水奖赏的配对，声音（8000Hz，75dB，100ms）为条件刺激（CS，conditioned stimulus），水为奖赏性非条件刺激（US，unconditioned  stimulus），CS结束到US起始之间为痕迹间隔（trace），时长1.2s。一次CS-US配对为一次试验（trial），大多数小鼠可在200至300个trial中展示良好的行为学表现。训练次日，仅给与小鼠声音刺激而不给水，观察小鼠对CS的反应来检测小鼠对前日声音-水奖赏联合学习的记忆。假手术学习组行为学流程与学习组类似，仅在第5天小鼠进行训练时将CS与US顺序调换。

行为学装置示意图与学习组对应阶段行为学方案

A.装置适应期（第1-4天），水头仅给与水，给水间隔9-15s内随机；

B条件训练日（第5天），声音-水配对，间隔1.2s，给水窗口结束时水头吸水，相邻配对间隔9-15s内随机，并伴随有相应电生理实验的记录；

C检测日（第6天），仅给与声音刺激，水头不给水，声音间隔9-15s内随机。水管上箭头：给水与吸水；CS：条件刺激；US：非条件刺激。

行为学表现的衡量

随着trial数的增加，小鼠舔水动作分布（lick）逐渐集中于CS后与给水区间，表明小鼠逐渐掌握声音-水奖赏的联合。学习全程舔水动作的分布图显示CS后小鼠舔水频率骤然上升。次日，仅给CS的检测中，小鼠舔水动作集中于CS后，表现出对声音-水奖赏联合的记忆。而假学习组小鼠在训练过程中和次日的检测中均未表现出对声音后舔水的偏好。

学习组与假学习组小鼠学习过程与检测展示

A学习组为小鼠训练过程中舔水图（上），每个点表示一次舔水；整体舔水分布图（下），组距为0.2s；

B假学习组为小鼠训练过程中舔水图（上），每个点表示一次舔水；整体舔水分布图（下），组距为0.2s；

C（A）中学习小鼠次日仅给予声音刺激检测结果；

D（B）中假学习小鼠次日仅给予声音刺激检测结果。黑色背景条标记声音刺激，蓝色背景条标记给水区间。

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