细菌界的“美妆教程”：打底、定妆、卸妆、补色 | 科学世界·视点

去医院做感染检查，或是翻看抗生素说明书时，你大概率见过这样的拗口名词：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。医生凭这短短几个字，就能快速区分致病菌大的种类。它们的背后，是一套沿用了一百多年的细菌鉴别方法，那就是大名鼎鼎的革兰氏染色法。

它没有基因测序动辄数万的设备成本，不用复杂质谱仪器，仅几瓶试剂、四步简单操作，就能把在显微镜下看起来完全透明的细菌分出两大阵营。诞生于19世纪的它，历经电子显微镜、高通量测序、全自动微生物检测设备的轮番冲击，至今仍是全球每一间微生物实验室、医院检验科的入门必修课。

显微镜下“大海捞针”，难倒了整个医学界

19世纪80年代，微生物学正站在时代分水岭。路易·巴斯德证实微生物是传染病元凶，罗伯特·科赫建立起细菌分离培养的基础方法，但摆在所有医生面前有一道无解难题：细菌尺寸仅微米级别，通体近乎透明，把含有细菌的样本滴在玻片上放到显微镜下观察，如同把透明玻璃渣丢进清水，根本无法分辨轮廓，更别提还要区分组织里混杂的致病菌。当时观察病灶，只能在一片灰蒙蒙的视野里徒劳寻找，被业内调侃为“大海捞针”。

光学显微镜下看到的染色后的大肠杆菌（革兰氏阴性菌，红色）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌，紫色）。放大100倍。

停尸房里，一位丹麦医生“无心插柳”

故事的主角汉斯·克里斯蒂安·革兰（1853～1938），生于丹麦哥本哈根，1883年10月他赴柏林，在德国病理学家、微生物学家卡尔·弗里德伦德尔的病理学实验室工作。彼时大叶性肺炎致死率极高，病人往往在短短数天内呼吸衰竭离世，而医生始终看不清肺组织里的致病菌，自然无从对症治疗。革兰致力于开发一种能在肺组织切片中特异性显示致病菌、同时不染色宿主细胞核的染色方法。

当时学界已有简单的生物染料，但染色效果极差，在镜下看时，细菌和人体细胞糊成一团。革兰开始反复调配苯胺龙胆紫、碘、酒精的组合，在数十份肺部病理切片上反复试错。某天，他完成一套完整染色流程后，显微镜下出现了前所未有的清晰画面：一部分细菌牢牢锁住深紫色，任凭酒精冲洗也不褪色；另一类细菌的紫色被酒精彻底洗脱，最后用红色复染液上色，变成鲜亮的粉红色。

这个极具颠覆性的现象，并没有让革兰立刻意识到自己创造了细菌分类的基石。

论文发表后，全球微生物学家纷纷复刻这套染色方案，慢慢发现：细菌的着色倾向不是随机的结果，而是它们与生俱来、稳定不变的固有特征。依据颜色，细菌被划分为两大基础类群——革兰氏阳性菌（G+，紫色）、革兰氏阴性菌（G-，红色）。一项出自病理观察的辅助手段，阴差阳错搭建起细菌分类学最核心的框架，成为科学史上“无心插柳”的经典案例。

汉斯·克里斯蒂安·革兰（1853～1938）

给细菌“全套化妆”：打底、定妆、卸妆、补色

如今标准化的革兰氏染色法有四步，很多实验初学者戏称它是给细菌“全套化妆”：打底、定妆、卸妆、补色。操作全程不超过5分钟，门槛极低。但简单操作的背后，是染料、酒精与细菌细胞壁之间精密的物理、化学反应，每一步都在为最终的色彩分化埋下伏笔。

第一步：初染——结晶紫统一打底。

涂片风干、火焰固定后，滴加结晶紫染液覆盖细菌1分钟。结晶紫属于碱性染料，分子带正电，而细菌的细胞壁、核酸整体带负电，正负电荷相互吸引。因此，所有细菌，无论后续会变紫还是变红，此刻都会被染成均匀的深紫色。这一步没有任何区分效果，只是给透明细菌统一披上紫色外衣，相当于化妆前的基础底妆。

第二步：媒染——碘液充当定妆散粉。

蒸馏水冲洗干净结晶紫，再滴加卢戈氏碘液（即碘的碘化钾溶液）静置1分钟。碘本身没有染色能力，核心作用是络合反应：碘分子钻进细菌内部，和结晶紫分子结合，形成体积更大、结合力更强的结晶紫-碘大分子复合物。原本细小的染料分子可以在细胞内自由穿梭，结合大分子后，会牢牢嵌在细胞壁缝隙里，大幅提升锁色能力，为后续酒精“卸妆”制造分化条件。

第三步：脱色——脱色剂，整场染色的胜负手。

这是最关键、最容易出错的一步，也是阴性和阳性菌分道扬镳的节点。手持玻片，缓慢滴加脱色剂（通常为95%的乙醇或丙酮），轻晃玻片20～30秒，立刻用流水冲洗。脱色剂兼具脂溶性与水溶性，对两种细菌的细胞壁会产生完全相反的破坏效果。此时，阳性菌：厚肽聚糖层脱水收缩，孔隙闭合，大分子染料被锁在细胞内部，颜色丝毫不褪；阴性菌：外层脂质膜直接被乙醇溶解，单薄的肽聚糖挡不住冲刷，紫色复合物全部渗出，菌体变回透明。这一步的脱色时间全靠经验把控。如果脱色剂冲洗太久，哪怕阳性菌也会慢慢掉色；若冲洗时间太短，阴性菌也会残留紫色，极易造成结果误判。实验室新人最常翻车的环节，就是这短短几十秒的脱色步骤。

脱色洗净后，滴加番红复染30秒。原本保留紫色的阳性菌，不会被淡红色染料覆盖；彻底脱色、通体透明的阴性菌，则会吸附红色染液，最终呈现粉红色。一套流程走完，在显微镜分别通过低倍镜和高倍的油镜观察，视野层次分明：紫色菌、红色菌各自独立，仅凭颜色就能快速完成大类划分。

革兰氏染色法的步骤

结核杆菌为什么很难被常规染料着色，后来为什么需要抗酸染色？

革兰氏染色法如何把微观结构差异，转化成肉眼可见的色彩区别？

更多内容欢迎阅读《科学世界》2026年第8期文章“视点”栏目文章——《百年染色术区分细菌世界的经典色彩》。

本文摘编自杂志2026年第8期，文章内容略有删改。

实习编辑 | 周欣颖