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【科技前沿】周鸣/颜宁课题组合作揭示人源二酰甘油酰基转移酶DGAT1 三维结构及催化机制

2020-05-15 02:50

来源：澎湃新闻·澎湃号·政务

三酰甘油酯（triacylglycerol， TAG）是生命体中主要的能量储存物质，其合成过程主要有两种路径：3-磷酸甘油路径以及单酰基甘油路径【1】。两种合成路径的最终一步都是二酰甘油酯（diacylglycerol，DAG）的酰基化从而产生TAG，而这一过程是由二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol-O-Acyltransferase, DGAT）催化完成【2】。人体中有两种序列不同源的DGAT，分别为DGAT1和DGAT2。DGAT1 主要负责脂肪吸收及储存过程中TAG的合成，DGAT2则负责各组织及皮肤基本脂肪的平衡。前期研究表明，DGAT1敲除的小鼠能保持正常的代谢，并且可以抵抗高脂肪饮食引起的肥胖，而DGAT2敲除的小鼠则由于皮肤脂肪的缺失在出生数小时内死亡【3】。因此，DGAT1被认为是重要的治疗肥胖及糖尿病的药物靶点，各药物公司都有针对DGAT1抑制剂开发【4】。

根据序列同源性，DGAT1属于跨膜O-酰基转移酶超家族（Membrane-bound O-acyltransferase superfamily, MBOATs）。MBOATs 超家族是一类广泛存在于不同物种中的多次跨膜酰基转移酶，其成员包括：催化TAG合成的DGAT1【5】，催化胆固醇酯化的酯酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶（Acyl-CoA: cholesterol Acyltransferase，ACAT ）（注：今日Nature同步在线的另一篇来自颜宁教授课题组的工作解析了ACAT1的结构，详见文末报道。）【6】，以及催化蛋白质脂修饰的PORCN（Porcupine）【7】等。前期华盛顿大学许文清教授组解析了细菌来源的MBOATs超家族蛋白DltB8（），然而DGAT1和DltB有着级低的序列同源性以及截然不同的功能，因此难以通过DltB的结构来预测和研究DGAT1的结构以及底物识别反应机理。前期虽然有很多DGAT1功能相关的研究，但针对其多聚物分子结构、底物识别方式以及反应机理依旧没有明确的结论。

2020年5月13日，贝勒医学院周鸣授课题组和普林斯顿大学颜宁教授课题组合作在Nature上发表文章Structure and mechanism of human diacylglycerol-O-acyltransferase 1 （本文第一作者为贝勒医学院博士生王列，普林斯顿大学钱洪武博士、贝勒医学院的年寅博士，普林斯顿大学韩亦沫博士以及为共同一作。韩亦沫博士现为莱斯大学助理教授，年寅博士现为昆明动物所研究人员）。该工作利用单颗粒冷冻电镜技术，首次解析了分辨率为3.1Å人源DGAT1的同源二聚体结构，并通过结合酶活性实验，确定了酰基辅酶A（acyl-CoA）在DGAT1上的结合位点。

在体外过表达并纯化得到人源DGAT1后，为了精确测量DGAT1的活性，研究人员发展了一种酶联反应测试：DGAT1将acyl-CoA上的脂肪链转移到DAG上后，产生的CoA会被α-酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，αKDH）所利用并转化为琥珀酰-CoA，同时生成NADH。因此可以通过产生NADH的荧光来间接测量DAG转化为TAG的速率，并且比直接测量DAG的生成速率更简单且准确。结果显示，测得数值与前期报道的微粒体中活性相当，纯化后的DGAT1依旧保持较好活性。

结构数据显示，DGAT1的N端位于细胞质内，C端位于内质网内，单个DGAT1分子主要由9个跨膜α螺旋组成（transmembrane helix, TM）。两个DGAT1分子形成同源二聚体，二聚体中心为TM1和N端无规则卷曲与另一个DGAT1分子之间形成紧密的相互作用，中间的空间由纯化所用的去垢剂和蛋白结合的脂质分子填充。剩下的TM2-TM9以及胞内卷曲IL1/IL2在内质网膜中形成一个帐篷形状的结构，其中心有一个很大的疏水空腔。因为此结构与其他MBOATs成员（DltB以及ACAT1）的结构有明显的共性，研究人员命名为MBOAT 结构（MBOAT fold），其中的空腔命名为反应室（reaction chamber）。根据前期研究及序列保守性， DGAT1的活性中心H415/E416位于TM7中部，朝向反应室中。反应室有两个开口：一个小的开口在反应室的底部TM7-TM8-IL2之间，另外一个大的开口在TM4-TM6-IL1之间，将反应室延伸向内质网膜中。

结构显示，acyl-CoA结合于反应室小开口处，一直延伸到反应室内部。CoA部分结合于开口处IL2以及TM8上的极性残基，CoA向内延伸至活性位点附近，acyl-CoA的脂肪链则结合于反应室内高度疏水的口袋中。与acyl-CoA相互作用的多数残基在DGAT1中高度保守，并且突变后对DGAT1活性有显著影响，进一步的验证了acyl-CoA结合的位点。之前被认为是acyl-CoA结合位点的N端卷曲9以及FYXDWWN结构域10则与acyl-CoA并无直接相互作用。结构中虽然未确认DAG的结合位点，但研究人员在结构中发现，反应室大开口附近的残基多为非极性残基，且在大开口附近有类似脂肪链的分子结合。因此推断DAG很可能从大开口进入反应室中，从而接近于活性中心H415/E416。之后DAG的羟基被H415活化从而进攻acyl-CoA的硫醇基团，从而引起酰基转移反应的发生。最终，生成的产物TAG同样通过反应室的大开口释放到内质网膜中。

综上，本研究中报道了首个人源DGAT1同源二聚体结构以及其底物acyl-CoA的结合位点，对于针对DGAT1靶点抑制剂开发有重要指导作用。另外，DGAT1的结构也将为MBOATs超家族中其他成员的结构及功能研究提供重要的信息。

值得一提的是，Nature同步上线了另一篇背靠背的工作，解析了分子量为55 kDa的人类甘油三酯合成与代谢的关键酶——DGAT1的蛋白结构，并系统地阐明了DGAT1识别底物及催化甘油三酯合成的分子机制。该工作由哈佛大学公共卫生学院Robert Farese, Jr. （费波）教授& Tobias Walther（华涛北）教授联合课题组以及哈佛大学医学院廖茂富教授课题组合作完成，详细报道详见今日BioArt的单独报道。

另外，普林斯顿大学颜宁教授课题组也在同期Nature中发表文章Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1（本文第一作者为普林斯顿大学钱洪武博士，北大-清华生命科学联合中心Xin Zhao、西湖大学Renhong Yan为共同一作；钱洪武博士也为共同通讯）。该工作首次解析了分辨率为3.0Å和3.1 Å人源ACAT1的同源二聚体以及四聚体结构，并结合相关活性实验，确定了酰基辅酶A（acyl-CoA）在ACAT1上的结合位点以及底物识别的机理。